miRNA208a對擴張型心肌病模型大鼠心肌纖維化的影響

張金祝，李海德，尹桂華，姚宗芹，宋杰，趙蒙，趙明明

臨沂市中心醫院，山東臨沂276400

擴張型心肌病是一類以心力衰竭、猝死、惡性心律失常為臨床表現的常見心肌病，心肌纖維化是促進擴張型心肌病心功能惡化的關鍵因素［1］，逆轉心肌纖維化可能是治療擴張型心肌病的重要靶點。但是，擴張型心肌病心肌纖維化的發生發展機制目前尚不清楚。有研究表明，miRNA208a 在多種病因所致心肌纖維化的發生、發展中起重要作用［2-3］，但其對擴張型心肌心肌纖維發生發展的影響目前國內外文獻鮮有報道。2018 年4—11 月，我們通過構建擴張型心肌病大鼠模型，探討miRNA208a 對擴張型心肌病大鼠心肌組織中內皮素（ET）、肌球蛋白重鏈-β（MHC-β）、Ⅰ型膠原（COL-Ⅰ）等表達的影響，以期能部分闡明擴張型心肌病心肌纖維化發生發展的機制，從而為逆轉該病理變化提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性 Wistar 大鼠 30 只，7 周齡，體質量220～240 g，購自山東省動物實驗中心；阿霉素（10 mg/每瓶）購自北京嘉林藥業有限公司；兔抗大鼠多克隆抗體、HE 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購自武漢博士德公司；動物高分辨彩色超聲儀器（Visualsonics，Canada）。

1.2 動物模型制備及分組處理 采用連續腹腔注射阿霉素法制備擴張型心肌病大鼠模型，劑量為2.5 mg/kg，共注射6 周［4］。模型制備成功后，隨機分為 mut-miRNA208a 組 、antagomiRNA208a 組 、premiRNA208a 組，每組10 只。分別轉染含突變miR?NA208a、抑制 miRNA208a 表達、過表達 miRNA208a的腺相關病毒質粒。

1.3 心功能及心臟指數（HWI）檢測 轉染成功72 h后，應用動物心臟彩超獲取各組大鼠心室舒張末期內徑（LVEDD）、心室收縮末期內徑（LVESD）、左心室射血分數（LVEF）數據。重新稱量大鼠體質量后，2%戊巴比妥鈉針左下腹腔注射充分麻醉，取出各組大鼠心臟，用生理鹽水清洗，稱量各大鼠心臟質量，計算HWI，HWI=心臟質量/體質量。

1.4 心肌組織HE 染色 4%甲醛溶液固定心肌組織，石蠟包埋，切片。石臘切片依次放入二甲苯、乙醇脫蠟、蒸餾水浸洗后，蘇木紫染色，0.1%鹽酸乙醇分化。浸泡伊紅液染色，風干后中性樹膠封片，鏡檢觀察。

1.5 心肌組織Masson 染色 石蠟切片常規脫蠟至水洗，Weigert 鐵蘇木精染液染核，1%鹽酸乙醇分化，麗春紅酸性品紅染液染色；1%磷鉬酸溶液分化，甩干，苯胺藍染液復染；1%冰醋酸沖洗切片，快速水洗后，乙醇脫水，二甲苯透明、風干后中性樹膠封片，鏡檢并攝片。隨機選取5個視野，Olympus-BX50 顯微鏡攝像系統攝像觀察

1.6 心肌組織ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表達檢測采用RT-PCR 法。TRIzol 法提取心肌組織總RNA，嚴格按RT-PCR 試劑盒說明操作。選擇ET、MHC-β、COL-ⅠRNA 相應引物序列，RT-PCR 反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；40 個循環。繪制溶解曲線，心肌組織ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表達最終數據以 2-ΔΔCt進行分析。

1.7 心肌組織ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表達檢測采用Western blotting 法。石蠟組織切片脫蠟后行抗原修復封閉，然后分別滴加兔多抗GAPDH 抗體（1∶1 000 稀釋）、鼠單抗ET（1∶1 000 稀釋）、鼠單抗 MHC-β（1∶500 稀釋）、鼠單抗COL-Ⅰ（1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 洗去多余一抗后分別滴加封閉液稀釋（1∶50 000 稀釋）的HRP 標記羊抗小鼠、羊抗兔二抗。TBST 洗去多余二抗后滴加工作液覆上保鮮膜，X 線膠片壓片、顯影、定影，沖洗膠片用Band Scan 分析膠片灰度值，獲得心肌組織ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量數據用±s表示，三組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能及HWI 各組大鼠HWI、LVEDD、LVESD、LVEF 比較，差異均有統計學意義（P均<0.05）。見表1。

表1 三組大鼠心功能及HWI比較（±s）

表1 三組大鼠心功能及HWI比較（±s）

注：與mut-miRNA208a組比較，*P<0.05；與antagomiRNA208a組比較，#P<0.05。

組別mut-miRNA208a組antagomiRNA208a組pre-miRNA208a組n 10 10 10 HWI（mg/g）2.82±0.16 2.57±0.96*3.30±0.21*#LVEDD（mm）7.73±0.33 6.96±0.35*7.94±0.29*#LVESD（mm）4.02±0.41 3.42±0.25*4.38±0.24*#LVEF（%）72.0±1.61 76.1±1.16*69.3±1.54*#

2.2 各組大鼠心肌組織染色 HE 染色顯示，mutmiRNA208a 組、pre-miRNA208a 組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞間質模糊，細胞肥大、水腫；antagomiR?NA208a 組大鼠仍見細胞肥大、水腫，但心肌纖維排列稀疏，走形基本正常。Masson 染色顯示，心肌膠原纖維呈藍色，胞質呈紅色，胞核呈藍黑色；mutmiRNA208a 組心肌間質見大量膠原纖維分布，premiRNA208a 組較mut-miRNA208a 組膠原纖維顯著增多，而antagomiRNA208a 組心肌間質膠原纖維含量降低。

2.3 三組大鼠心肌組織ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表達 三組大鼠心肌組織ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表達差異均有統計學意義（P均<0.05）。見表2。

表2 三組大鼠心肌組織ET、MHC-β、COL-ⅠRNA表達比較（-x± s）

2.4 三組大鼠心肌組織ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表達 三組大鼠心肌組織ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表達差異均有統計學意義（P均<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織ET、MHC-β、COL-Ⅰ蛋白表達比較（±s）

注：與mut-miRNA208a組比較，*P<0.05；與antagomiRNA208a組比較，#P<0.05。

組別mut-miRNA208a組antagomiRNA208a組pre-miRNA208a組n 10 10 10 ET 蛋白0.37±0.024 0.15±0.005*0.94±0.025*#MHC-β蛋白0.45±0.010 0.22±0.008*0.83±0.004*#COL-Ⅰ蛋白0.28±0.016 0.13±0.001*0.46±0.012*#

3 討論

擴張型心肌病是慢性心力衰竭的重要病因，嚴重影響患者的生活質量和預期壽命，其主要病理生理變化為由心肌纖維化和心肌細胞受損所致的心肌重構。心肌纖維化主要表現為心肌間質內廣泛的異常纖維組織（主要為COL-Ⅰ、COL-Ⅲ）沉積。這些異常沉積的膠原蛋白可增加心肌的僵硬度，降低心室的舒張功能［4］。研究表明，在射血分數保留的心力衰竭類型中，COL-Ⅲ更能增加心室壁的僵硬度［5］；而這些異常排列的膠原蛋白和心肌細胞會直接損害心肌的收縮能力，促進心肌射血分數減退，導致心力衰竭的發生、發展［6］。ET 由血管內皮細胞產生，具有調控心肌成纖維細胞，直接刺激膠原蛋白沉積的作用［7］；MHC-β突變是擴張型心肌病的重要病因。

miRNA208a 是 miRNA208 家族一員，由 MHC-β基因編碼，特異性表達于心肌組織。本研究HE 染色顯示，mut-miRNA208a 組、pre-miRNA208a 組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞間質模糊，細胞肥大、水腫；antagomiRNA208a 組大鼠心肌纖維排列稀疏，走形基本正常。Masson 染色顯示，mut-miRNA208a 組心肌間質見大量膠原纖維分布，pre-miRNA208a 組較mut-miRNA208a 組膠原纖維顯著增多，而an?tagomiRNA208a 組心肌間質膠原纖維含量降低。過表達miRNA208a 可使擴張型心肌病模型大鼠心肌組織中 ET、MHC-β、COL-Ⅰ高表達，而抑制 miR?NA208a 的表達則可使擴張型心肌病模型大鼠心肌組織中ET、MHC-β、COL-Ⅰ表達減低，模型大鼠心功能得到改善。這提示miRNA208a可能通過或至少部分通過作用于其靶標ET、MHC-β而促進COL-Ⅰ高表達，從而導致模型大鼠心功能惡化。既往研究也表明，miRNA208a 促使心肌梗死模型大鼠心肌纖維化，而降低miRNA208a 的表達可減輕心肌纖維化的程度［3］。另有研究顯示，抑制miRNA208a 的表達可減輕高鹽飲食大鼠心肌肥厚及周圍血管纖維化程度［8］。機械牽張H9C2 細胞可通過TGF-β1刺激miRNA208a的表達，從而促進心肌細胞肥大及ET、COL-Ⅰ生成［9］。miRNA208a 主要通過其靶標ET、MHC-β 發揮其致心肌纖維化及心肌細胞肥大的作用［10］。研究顯示，在老年心肌組織中內皮素可促進心肌成纖維細胞膠原蛋白合成［11］，而COL-Ⅰ的過量合成則導致心肌纖維化，導致心功能降低［12］，上述研究結果與本研究結果較一致。

綜上所述，miRNA208a 在擴張型心肌病心肌組織纖維化中起重要作用。抑制心肌miRNA208a 的表達則可降低心肌組織中ET、MHC-β、COL-Ⅰ的表達，改善大鼠心功能。miRNA208a 可能是治療擴張型心肌病的重要靶標。