羧甲基殼聚糖-油酸聚合物的載藥性能及抗腫瘤活性研究

尤 靜，張文濤，苗延青，張雪嬌,梁玲玲

(西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021)

羧甲基殼聚糖(CMCS)具有良好的生物相容性、生物降解性及低毒性[1-3]。CMCS作為藥物載體可以增強生物大分子藥物的透膜能力，提高生物黏附性和生物可降解性，有助于促進生物大分子藥物在體內的吸收。同時，CMCS能有效誘導細胞毒性巨噬細胞，也能誘導嗜中性白細胞的積聚，增強藥物對腫瘤細胞的靶向性[4-8]。油酸(OA)屬于不飽和高級脂肪酸，具有良好的抗腫瘤活性[9-11]。但是油酸口服吸收差，生物利用度低，限制了以其為指標性成分的多種制劑的發展及利用。

CMCS接枝OA得到的兩親性聚合物，可通過自組裝方式包載疏水性抗癌藥物[12-15]，既能改善疏水性抗癌藥物的用藥局限，又能協同發揮更好的抗癌效果。鑒于此，作者以自制的羧甲基殼聚糖-油酸聚合物(CMCS-OA)為載體，采用透析法對鹽酸阿霉素(DOX)進行包載，初步考察CMCS-OA的載藥性能和載藥聚合物(DOX-CMCS-OA)的體外釋藥性能，并通過細胞毒性和細胞攝取實驗評價DOX-CMCS-OA的抗腫瘤活性。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

羧甲基殼聚糖-油酸聚合物(CMCS-OA)，自制；鹽酸阿霉素(DOX，98%)、PBS、高糖培養基、胎牛血清、MTT、吖啶橙，上海源葉生物科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺、三乙胺，分析純。

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限責任公司；UV-2102C/PC/PCS型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；FD-1型冷凍干燥儀，鄭州長城科工貿有限公司；ZEN3600型馬爾文激光粒度儀，Malvern Zetamaster UK；1510 Multiskan Go型自動全波長酶標儀，Thermo Fisher Scientific；U-LH100HG IX73型倒置熒光顯微鏡，Olympus。

1.2 載藥聚合物的制備

將6 mg DOX充分溶解于1.6 mLN,N-二甲基甲酰胺及0.4 mL三乙胺中，得到DOX反應液；另取15 mg CMCS-OA充分溶解于15 mL蒸餾水中，置于磁力攪拌器中；室溫條件下，將DOX反應液緩慢滴加到CMCS-OA溶液中攪拌反應30 min，待用。

將上述溶液置于截留分子量為8 000～14 000的透析袋中，用pH值為7.4的PBS緩沖液進行攪拌透析，每小時更換一次透析液，12 h后得到載藥聚合物(DOX-CMCS-OA)，冷凍干燥保存。

1.3 CMCS-OA的載藥性能評價

1.3.1 DOX標準曲線的繪制

精密量取一定體積的0.1 mg·mL-1DOX對照儲備液，置于棕色容量瓶中配制成濃度分別為10 μg·mL-1、15 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1、50 μg·mL-1的系列溶液，測定482 nm處吸光度，以吸光度(A)為縱坐標、濃度(c)為橫坐標，繪制DOX的標準曲線。

1.3.2 載藥量和包封率的測定

取一定質量DOX-CMCS-OA溶于蒸餾水中，以CMCS-OA溶液為對照，采用分光光度法測定吸光度，按下式計算DOX-CMCS-OA的載藥量和包封率：

(1)

(2)

1.4 DOX-CMCS-OA的體外釋藥性能

取1 mg DOX-CMCS-OA溶于3 mL蒸餾水中，置于透析袋中，兩端封口，在20 mL pH值分別為5.0和7.4的PBS緩沖液中進行攪拌透析，溫度為37 ℃。于不同時間間隔取出5 mL PBS緩沖液，并補充相應量的新鮮PBS緩沖液，采用分光光度法測定并繪制DOX-CMCS-OA的體外釋藥動力學曲線。

1.5 DOX-CMCS-OA的抗腫瘤活性

1.5.1 細胞毒性實驗

取對數生長期的SGC-7901胃癌細胞和SK-MES-1肺癌細胞，用1640培養基稀釋至細胞濃度為5×104個·mL-1，接種于96孔板上，每孔100 μL；置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養24 h后，分別加入濃度為7.5～60 μg·mL-1的DOX溶液、DOX-CMCS-OA溶液(所含DOX濃度為7.5～60 μg·mL-1)及空白培養液，繼續培養24 h，棄去加入的溶液；每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液100 μL，繼續培養4 h后，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩混勻，用酶標儀測定各孔在490 nm處的吸光度，計算細胞抑制率。

1.5.2 細胞攝取實驗

取對數生長期的SGC-7901胃癌細胞和SK-MES-1肺癌細胞，用1640培養基稀釋至細胞濃度為15×104個·mL-1，接種于6孔板上，每孔2 mL；置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養24 h后，棄去培養液，分別加入DOX溶液、DOX-CMCS-OA溶液(所含DOX濃度相同)，再分別培養1 h、12 h、24 h后，用PBS緩沖液漂洗3次；加入70%酒精，繼續培養30 min，用PBS緩沖液漂洗3次；加入20 μg·mL-1吖啶橙熒光染色劑對細胞核進行熒光染色，培養10 min后，用PBS緩沖液漂洗3次；每孔加入500 mL PBS緩沖液，采用熒光顯微鏡觀察細胞攝取藥物的情況。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜分析及DOX的標準曲線(圖1)

由圖1可知， DOX的最大吸收波長為482 nm，此處CMCS-OA的吸收較小，表明CMCS-OA對DOX的吸光度測定不會造成干擾。對DOX的標準曲線進行擬合，得回歸方程為A=0.016c-0.036，相關系數R2=0.995，表明DOX濃度在10～50 μg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好，可以進行定量分析。

圖1 CMCS-OA(a)、DOX(b)的紫外光譜及DOX的標準曲線(c)Fig.1 UV spectra of CMCS-OA(a),DOX(b) and standard curve of DOX(c)

2.2 CMCS-OA的載藥性能(表1)

由表1可知，當DOX加入量為2.5 mg時，載藥量和包封率達到最大，分別為30.28%和65.83%，表明一定質量的CMCS-OA對DOX的自組裝包載能力是有限的。

表1 DOX-CMCS-OA對DOX的載藥量和包封率

2.3 不同pH值下DOX-CMCS-OA的體外釋藥性能

載藥聚合物注入機體后，藥物殺死腫瘤組織需要較高的濃度，這就要求載體能夠識別腫瘤組織，在血液循環中防止藥物的突釋效應，而在腫瘤組織中能夠大量釋放[6]。由于腫瘤組織細胞的pH值比正常組織細胞低，選取pH值分別為5.0和7.4的PBS緩沖液作為環境介質，不同pH值下DOX-CMCS-OA的體外釋藥動力學曲線見圖2。

圖2 不同pH值下DOX-CMCS-OA的體外釋藥動力學曲線Fig.2 In vitro drug release kinetic curves of DOX-CMCS-OA at different pH values

由圖2可知，DOX-CMCS-OA的釋藥分為3個階段：(1)由于濃度差導致的初期藥物的突釋階段；(2)藥物穩定釋放階段，為藥物的主要釋放階段，藥物從聚合物內部向外部擴散，同時DOX-CMCS-OA逐步降解，這期間藥物可以在較長時間內維持穩定的釋放速度；(3)當DOX-CMCS-OA降解到一定程度時發生全面分解，從而使藥物全面釋放。1 660 min時，pH值為5.0和7.4的累積釋藥率分別為262.29%和232.64%，表明DOX-CMCS-OA在偏酸性環境下的釋藥效果更好，具有一定的pH值敏感性。

2.4 DOX-CMCS-OA的抗腫瘤活性

2.4.1 細胞毒性實驗

DOX、DOX-CMCS-OA對SGC-7901胃癌細胞和SK-MES-1肺癌細胞的抑制率比較如圖3所示。

由圖3可知，DOX-CMCS-OA對兩種癌細胞的毒性均小于藥物DOX，但依然具有細胞抑制作用。這是由于，DOX被包載在CMCS-OA載體中，需要一定時間才能釋放出來，實際作用于細胞的有效藥物濃度低于DOX，導致了較低的細胞毒性。

圖3 DOX、DOX-CMCS-OA對SGC-7901胃癌細胞(a)及SK-MES-1肺癌細胞(b)的抑制率比較Fig.3 Comparison of inhibition rates of DOX and DOX-CMCS-OA on SGC-7901 gastric cancer cells(a) and SK-MES-1 lung cancer cells(b)

2.4.2 細胞攝取實驗

DOX、DOX-CMCS-OA與 SGC-7901胃癌細胞孵育不同時間的熒光顯微鏡照片如圖4所示。

a,c,e:DOX分別孵育1 h、12 h、24 h

由圖4可知，DOX孵育細胞1 h后，DOX的紅色熒光與吖啶橙在細胞核位置的綠色熒光幾乎重合，證明DOX聚積在細胞核部位，從細胞形態和數量來看，此時細胞仍有一定活力；DOX孵育細胞12 h、24 h后，紅色熒光和綠色熒光分布與孵育1 h基本相同，但細胞數量明顯減少，形態發生變化，DOX毒性發揮作用，大量細胞凋亡。DOX-CMCS-OA孵育細胞1 h后，紅色熒光圍繞綠色熒光呈環狀，完全不重合，說明DOX被包載在CMCS-OA中，無法快速進入細胞核；DOX-CMCS-OA孵育細胞12 h后，細胞形態和數量較孵育1 h時變化不明顯，但細胞核綠色熒光處已有少量紅色熒光出現；DOX-CMCS-OA孵育細胞24 h后，紅色熒光只有少量仍呈環狀，大部分擴散成一團與綠色熒光重疊，此時細胞也出現大量凋亡，說明DOX從CMCS-OA中釋放出來，累積到細胞核中，發揮細胞毒性作用。

3 結論

以自制的CMCS-OA為載體，采用透析法對DOX進行包載，DOX-CMCS-OA的載藥量和包封率分別達到30.28%和65.83%。體外釋藥實驗表明，DOX-CMCS-OA在 pH值為5.0和7.4下1 660 min時累積釋藥率分別為262.29%和232.64%，偏酸性環境下釋藥效果更好，具有一定的pH值敏感性。細胞毒性實驗表明，DOX-CMCS-OA 對SGC-7901胃癌細胞和SK-MES-1肺癌細胞均具有較好的抑制作用且比DOX的毒性更低。熒光顯微鏡觀察細胞攝取過程發現，在同一條件下DOX-CMCS-OA進入細胞核的速度比DOX更慢，說明藥物有更長效的抑制腫瘤細胞作用。CMCS-OA對DOX的包載能力較好，具有一定的緩釋、長效的抗腫瘤作用。