半連續發酵對提高阿維菌素放罐體積的影響

程 曦，劉麗虹，劉進峰，高亞琪

(1.河北興柏農業科技有限公司 河北省阿維菌素生物技術重點實驗室，河北 石家莊 051530；2.石家莊市農業技術推廣中心，河北 石家莊 050000)

阿維菌素是阿維鏈霉菌在含有碳源、氮源、無機鹽和微量元素的培養基中通氣攪拌、深層發酵產生的具有十六元大環內酯結構的多組分生物殺蟲殺螨劑[1]。在其發酵液含有的 8 種組分中，B1a 組分的殺蟲效果最佳，是商品化阿維菌素的主要組分[2]。業內將B1a含量作為衡量發酵效價高低的指標。自阿維菌素被發現以來，通過菌種改良、配方及控制工藝的優化，生產水平大幅提高，不過這些措施均以提高發酵效價為目標，關于提高阿維菌素放罐體積的報道卻很少。阿維鏈霉菌作為一種絲狀菌，其發酵液總體表現為非牛頓流體性質，并滿足剪切稀化特征[3]。在其發酵過程中常有大量泡沫產生，泡沫的存在影響了放罐體積的提高。統計顯示，阿維菌素發酵放罐體積約為發酵罐容積的70%，而同為絲狀菌的慶大霉素、恩拉霉素發酵放罐體積為發酵罐容積的75%～80%。若采用半連續發酵提高放罐體積，不失為另一種提高阿維菌素發酵產量的途徑。

半連續發酵，我國工業界通俗地稱其為發酵帶放工藝[4-5]，是指在分批培養的基礎上，放出部分含有目標產物的發酵液，然后補入相同體積的新鮮培養基繼續發酵的方法[6]。在青霉素、頭孢菌素工業生產中已成功應用[7-8]；但在其它的以次級代謝產物為目標的發酵帶放工藝中應用較少。除了操作復雜、增加工作量及雜菌污染的機會外，更重要的原因是，補入新鮮培養基會稀釋生物量；而菌絲的生長有個過程，可能對生產效率有一定程度的影響。阿維鏈霉菌發酵過程中，液位隨培養時間延長逐漸上升，為防止“逃液”常需倒出部分發酵液至其它容器中繼續培養或隨其它發酵罐帶放[9]，在這一過程中,為提高設備利用效率，需將幾種不同時期的部分發酵液倒入一臺小型容器中混合培養。在對這一現象的長期觀察中，發現效價的增長并不因幾種不同時期、不同效價發酵液混合而受到影響。以此類推，如果發酵罐帶放后補入適當時期發酵液替代傳統的新鮮培養基，既可避免生物量的波動，又有利于效價的持續增長。因此，有必要研究補入不同的基質對發酵產量的影響。

鑒于此,作者在100 L、50 L發酵罐中研究阿維鏈霉菌發酵過程中補入補料培養基和補入發酵液對發酵過程的影響，為阿維菌素工業化生產實施半連續發酵工藝提供理論和數據支持。

1 實驗

1.1 菌種與設備

菌種，阿維鏈霉菌AVS-32，河北省阿維菌素生物技術重點實驗室。

20 L種子罐、50 L發酵罐、100 L發酵罐，配備有補料、DO和pH值等自動控制系統和具有數據采集及分析功能的軟件系統，鎮江東方生物工程設備技術公司。

1.2 培養基與培養條件

1.2.1 種子罐

培養基：淀粉20 g·L-1，黃豆餅粉5 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，花生粉5 g·L-1，氯化鈷10 mg·L-1；消后體積為13 L，pH值7.2～7.6。

培養條件：溫度28～29 ℃，空氣流速1.0～1.2 L·L-1·min-1，攪拌轉速200～600 r·min-1，培養時間40～50 h。

1.2.2 發酵罐

培養基：淀粉170 g·L-1，黃豆餅粉27 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，輕質碳酸鈣1.5 g·L-1，硫酸銨0.3 g·L-1，淀粉酶質量分數0.025%。接種量8%～10%。

培養條件：溫度 27～28 ℃，空氣流速0.8～1.2 L·L-1·min-1，攪拌轉速400～600 r·min-1，發酵周期320～340 h 。

補料培養基同發酵罐培養基。

1.3 檢測方法

1.3.1 生物量測定

準確量取50 mL發酵液置于250 mL三角瓶中，加入適量助濾劑，加熱至90～100 ℃， 抽濾，適量水洗，105 ℃下烘干2 h 至恒重(W2)，按式(1)計算生物量(g·L-1)：

生物量=(W2-W0-W1)×20

(1)

式中：W0為濾布質量，g；W1為助濾劑質量，g；20為換算系數。

1.3.2 B1a效價測定

準確量取2 mL發酵液置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲浸提15 min，定容，過濾，進行HPLC分析。色譜柱C18(250 mm×4.6 mm)，流動相 CH3OH-H2O(90∶10，體積比)，流速 1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長246 nm，進樣量20 μL。記錄峰面積，采用外標法按式(2)計算B1a 效價(g·L-1):

(2)

2 結果與討論

2.1 B1a 效價和生物量隨培養時間的變化趨勢

了解阿維菌素發酵過程中效價和生物量的變化趨勢，有助于確定不同基質補入工藝的優劣。50 L 發酵罐 B1a 效價、生物量隨培養時間的變化趨勢見圖 1。

圖1 B1a效價和生物量隨培養時間的變化趨勢Fig.1 Change trend of B1a titer and biomass with culture time

由圖1可知，發酵前40 h為對數生長期，菌絲快速生長，36 h時生物量相對飽和，生物量達45.6 g·L-1；此后，由于料液的蒸發，發酵液體積減小，生物量仍有所增加，但增速放緩。當發酵進行約50 h時，開始阿維菌素的生物合成，合成速率逐漸加快，100 h后B1a效價呈線性增長。50 L規模發酵過程顯示，阿維菌素是阿維鏈霉菌在菌絲生長繁殖到一定階段后開始合成的，為典型的次級代謝產物，其發酵過程為非生長偶聯型。

2.2 補入不同基質對生物量和B1a效價的影響

補料一般是指發酵進行到產物生成階段，因合成產物或維持細胞代謝活動的需要，選擇性地補充營養物質，使之向著產物積累的方向發展[10]。將100 L發酵罐中培養至237 h的發酵液等分至2臺50 L發酵罐中培養，并分別補入體積分數(V補/V混)為15%的補料培養基和培養67 h的發酵液，比較生物量和B1a效價的變化情況，結果見圖2。

由圖2a可知，補入補料培養基后由于料液的稀釋,生物量由50.8 g·L-1下降至46.7 g·L-1，此后較快增長；329 h時生物量達到52.7 g·L-1，與補入發酵液的生物量接近。這是由于，補料培養基為含有碳源、氮源、無機鹽和微量元素的復合培養基，造成菌絲一定程度的二次生長繁殖；而補入發酵液后，生物量增加幅度相對較小。

圖2 補入不同基質對生物量(a)和B1a效價(b)的影響Fig.2 Effects of adding different matrixes on biomass(a) and B1a titer(b)

由圖2b可知，補入補料培養基和發酵液后由于稀釋作用，239 h之前B1a效價均大幅下降，此后B1a效價呈線性增長(圖3)，并且補入發酵液(斜率K=0.0375)比補入補料培養基(斜率K=0.0346)效價增長快。需要特別注意的是，阿維菌素發酵動力學研究表明，阿維菌素是阿維鏈霉菌生長繁殖到一定階段才開始合成的。補料后菌絲的二次生長繁殖并未造成效價增長停滯，而且多次試驗均重復了這一現象。可能與菌絲已經具有了次級代謝能力有關；其次，補入的補料培養基對某些有害代謝產物的稀釋改善了合成環境，有助于加速阿維菌素的合成，表現出菌絲生長繁殖與產物合成同時進行的混合型發酵特征。由此，可以根據設備配置及實際生產情況，在某些特定情況下的工業化生產，帶放后可適時選擇補入復合培養基，最大限度地提高生產效率。孫文敬等[6]也研究表明，補料及放料策略的優化是提高產量的關鍵手段。

圖3 B1a效價對培養時間的回歸曲線Fig.3 Regression curves of B1a titer and culture time

2.3 補入不同數量的發酵液對B1a效價增長的影響

為了既利用菌絲的次級代謝能力，又能提高發酵液培養設備的利用效率，選擇補入培養 50 h 后的發酵液。將100 L發酵罐中培養至240 h的發酵液等分至 A、B 2臺 50 L 發酵罐后，分別補入培養58 h發酵液 5 L(體積分數 15%)和 2.5 L(體積分數 8%)，繼續培養至336 h，觀察B1a效價變化情況，結果見表 1。

由表1可知，由于補入低含量發酵液的稀釋作用，242 h B1a效價較240 h均有所下降，而后又快速增長。補入發酵液前后，B1a效價隨培養時間變化的回歸曲線見圖 4。

表1 B1a效價隨培養時間的變化

圖4 補入發酵液前(a)、后(b)B1a效價對培養時間的回歸曲線Fig.4 Regression curves of B1a titer and culture time before(a) and after(b) adding fermentation broth

由圖4可知，補入發酵液后回歸方程的斜率(罐A0.036 4、罐B 0.029 8)大于補入發酵液前(0.026 6)，且補入發酵液多的A罐大于B罐；即補入發酵液后效價增速更快，且補入的發酵液越多，效價增長就越多，后續試驗也重復了這一現象。這是由于補入發酵液，除了補充營養外，還減輕了代謝產物的抑制，保持了菌體活力的穩定，有利于效價的持續快速增長。

由圖4b可知，補入低含量發酵液越多，效價增長就越多；但同時對補發酵液前效價的稀釋作用也越明顯。為準確表達補入發酵液后效價的相對增長情況，為工業化生產確定放罐時間提供理論依據，將試驗效價與回歸效價進行對比，結果見表2。

表2 試驗效價與回歸效價對比

由表2可知，盡管補入體積分數15%的發酵液(A罐)，效價增速更快，但由于稀釋作用更明顯，288 h之前試驗效價均低于回歸效價，即在此之前不宜放罐；當培養至312 h時試驗效價較回歸效價高0.018 g·L-1，即宜選擇在此之后(補入發酵液72 h后)放罐；補入體積分數8%的發酵液(B罐)，效價增速相對較慢，但由于稀釋作用相對不明顯，288 h時試驗效價較回歸效價高0.197 g·L-1，即宜選擇在此之后(補入發酵液48 h后)放罐。

2.4 工業化應用探討

工業化生產以最大限度的提高產能、降低成本為終極目標。如何更高效地使用有限的設備是不容忽視的問題。通常的發酵設備配置，除了大容積發酵罐，還有對應的種子罐及其它小容積發酵罐。三級發酵工藝可以縮短發酵周期增加放罐批次，進而提高大容積發酵罐使用效率；提高小容積發酵罐的使用效率也是提高發酵產能的途徑之一。帶放工藝由來已久，但用于次級代謝發酵工藝較少，其中，困擾生產人員的主要問題是，帶放盡管增加了當時的放罐體積，但隨之而來的是帶放罐批體積減小的部分怎么補充。首先是補水，在慶大霉素的產物合成與菌體生長同時進行的混合型高密度發酵中有所應用；但阿維菌素發酵液總體表現為非牛頓流體性質，其表觀黏度隨培養時間的延長而降低，屬于擬塑性流體[11]，后期補水顯然不利于效價的增長。其次是補料，單純的補淀粉，意味著碳氮比失衡及總生物量減少，產品得率不高；作者就此研究了在發酵中后期補入補料培養基并與補入發酵液對比，結果顯示補入補料培養基劣于補入發酵液。再次是補入發酵液，補入中后期發酵液意味著補入了一定數量的阿維菌素，對效價的稀釋作用小但也失去了帶放的意義；補入的發酵液培養時間越短，意味著小型發酵設備的利用效率越高，但還應考慮利用菌體的次級代謝能力，所以最優的選擇是補入培養50 h后的發酵液。就此研究結果，嘗試在單罐容積120 m3發酵罐上應用；將30 m3或12 m3容器作為發酵液培養罐，采用半連續發酵工藝后發酵單罐產量又上新臺階。

3 結論

通過在100 L、50 L發酵罐中進行平行試驗，在發酵中后期補入體積分數15%的培養50 h后的發酵液優于補入補料培養基，即發酵罐帶放后可選擇補入培養50 h后的發酵液替代其它基質。補入體積分數15%的發酵液較補入體積分數8%的發酵液效價增長得更快，但稀釋作用也更明顯。本研究為阿維菌素工業化生產實施半連續發酵，高效利用小容積發酵罐提供了新思路、新方法。其本質等效于將小容積發酵罐的發酵周期由330 h縮短至50～100 h,即大幅度縮短了發酵周期。半連續發酵是一種重要的生化培養方式，該研究對其它以次級代謝產物為目標產物的半連續發酵的實施具有一定的借鑒價值。