應用微衛星技術分析評價虎皮貓群體的遺傳質量*

王 洪 付 瑞 魏 杰 賈松華 光嬌娜 馬麗穎 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

實驗動物是支撐生物醫學研究發展的基礎學科，保證實驗動物的質量是保障我國科研工作質量的重要前提。實驗動物同科學儀器和科學試劑一樣，不僅需要進行標準化生產，而且需要對其進行質量控制，這是實驗動物與非實驗動物的重要差別。實驗動物的質量控制包括遺傳質量控制，微生物質量控制，營養和環境質量控制等很多方面。其中，實驗動物的遺傳質量關乎動物實驗結果的重復性和可信性，甚至決定科研項目的方向和成敗。因為實驗動物本身的特殊性，在動物的飼養和繁育過程中，遺傳漂變會不可避免地發生，遺傳漂變的不斷累積，將會導致實驗動物遺傳結構和遺傳背景的改變，進而影響科研工作的實驗結果。如何最大限度地控制遺傳漂變，保證實驗結果的可重復性：一方面，應采取科學規范的飼養繁育方式；另一方面，應定期對實驗動物開展遺傳質量檢測。

分子標記是評價群體遺傳多樣性的工具。實驗動物的遺傳質量控制手段包括生化標記檢測法，微衛星DNA標記檢測法等[1]，其中，微衛星方法是國際通用的實驗動物遺傳質量控制技術。微衛星是廣泛存在于真核生物基因組中的短串聯重復序列，核心序列為2～6個bp。不同動物個體的核心序列重復次數不同，通過PCR、電泳和測序等多種技術手段識別不同動物微衛星片段的差異，從而形成不同品系和不同群體所特有的遺傳背景和遺傳結構。實驗動物的遺傳結構信息可以作為該品系遺傳質量評價的標準依據，同時亦可為動物實驗結果的可靠性提供保證。

實驗用貓是眼科疾病斜視弱視動物模型，在降壓物質檢查試驗中不可或缺[2-3]。本研究中的虎皮貓是華北制藥廠于二十世紀七十年代末開始培育的我國特有的實驗用貓[4]。該群體是我國歷史最悠久的實驗用貓群體，亦是我國最早作為實驗用動物應用于生物醫學研究中的實驗貓。目前，關于實驗用貓群體遺傳多樣性的研究資料甚少，隨著我國實驗動物標準化體系的不斷完善，實驗用貓的遺傳質量控制標準即將發布。為保證虎皮貓群體的遺傳質量，本研究中，利用37個微衛星位點對該虎皮貓群體的25只動物的DNA樣本進行遺傳質量分析評價，旨在為虎皮貓群體在生物醫藥領域的應用提供質量保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：本研究使用的虎皮貓血液樣本由華北制藥廠提供，成年虎皮貓的數量是25只。實驗用貓經舒泰麻醉，前肢采集血液入抗凝管，4 ℃保存備用。

1.1.2儀器和試劑：電泳儀Bio-Rad POWERPAR BASIC，DNA微量分析儀NanoPhotometer，PCR擴增儀ABI VeritiTM 96，凝膠成像分析系統GelLogic 212Pro。

DNA marker，Taq 酶，dNTP和10×PCR buffer由Takara提供。ExRed 核酸染料，購自莊盟生物。

1.2 方法

1.2.1虎皮貓基因組DNA提?。阂罁斗肿涌寺≈改稀?，采用NaI方法提取基因組DNA[5-6]。利用DNA微量分析儀測定基因組DNA濃度，DNA工作液濃度為50～100 ng/μL，保存于4 ℃備用。

1.2.2微衛星位點選擇和引物合成：基于本課題組的前期研究成果，選擇37個有效擴增微衛星位點，[4]引物合成由上海生工有限公司完成。

1.2.3PCR和電泳[7]：PCR反應體系包括：10×buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(A,C,T,G各2.5 mmoL/L)1 μL，上下游引物(100 μmoL/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板(50-100 ng/μL)1 μL，無菌水13.8 μL。

PCR反應程序包括：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 7 min。

2.5 瓊脂糖電泳，120 V 30 min，ExRed染色。

1.2.4基因測序：測序由擎科基因測序有限公司完成。測序結果經GeneMapper 4.0軟件處理，讀取每一份DNA在所有微衛星位點的片段長度。

1.3 統計方法

應用軟件Popgen 1.32，計算該實驗用貓群體的等位基因數，雜合度等參數。應用PIC CALC2.0軟件計算該實驗用貓群體的多態性信息含量(polymorphism information content, PIC)。

2 結果

2.1 虎皮貓基因組DNA提取結果

25只虎皮貓的全血樣本DNA提取結果詳見表1，圖1和圖2。

表1 25份全血樣本DNA濃度

圖1 1～12號動物基因組DNA瓊脂糖電泳圖

圖2 13～25號基因組DNA瓊脂糖電泳圖

2.2 微衛星位點的PCR產物電泳結果

虎皮貓群體在74個備選微衛星位點的PCR結果中有37個有效擴增位點具有良好的多態性(等位基因數≥4)，其中FCA1062的PCR產物的電泳結果詳見圖3和圖4。

圖3 1～12號虎皮貓在FCA1062位點的PCR產物電泳結果圖

圖4 13-25號虎皮貓在FCA1062位點的PCR產物電泳結果圖

2.3 STR掃描結果

STR掃描結果顯示，37個微衛星位點的PCR產物的片段長度可以量化，與瓊脂糖電泳的結果比較，可以定量分析實驗用貓群體的遺傳結構。FCA1062位點的基因測序結果詳見圖5和圖6。

圖5 FCA1062位點雜合基因型STR掃描結果

圖6 FCA1062位點純合基因型STR掃描結果

2.4 虎皮貓群體的遺傳結構信息

將基因測序結果輸入軟件POPGEN1.32和PIC，統計分析得到25只虎皮貓群體在37個微衛星位點的遺傳結構參數，該虎皮貓群體的平均雜合度為0.6021(0.3416-0.8088)，單因素方差分析觀測雜合度與期望雜合度，P值>0.05，二者不存在顯著性差異；平均多態性信息含量是0.552(0.3179-0.7874)；平均香農指數是1.1487(0.6800-1.9223)；平均有效等位基因數是2.6907(1.5188-5.2301)，單因素方差分析觀測等位基因數與有效等位基因數，P值<0.01，二者存在顯著性差異；37個位點中，32個位點的P值>0.05，處于哈代溫伯格平衡(Hardy weinberg equilibrium，HWE)，5個位點的P值<0.01，偏離哈代溫伯格平衡。具體數據詳見表2.

表2 25只虎皮貓在37個微衛星位點上的遺傳結構參數

3 討論

本研究在前期工作的基礎上[7]，應用37個微衛星位點分析華北制藥廠虎皮貓群體的遺傳結構，37個位點均表現出豐富的多態性(觀測等位基因數Na≥4)，多態性表示群體內的遺傳變異[8]，應用該37個多態性豐富的位點獲取該群體的遺傳結構信息。該群體的平均雜合度為0.6021(0.3416-0.8088)，介于0.5-0.7之間，符合封閉群群體的遺傳結構標準，表明該群體已達到封閉群實驗動物標準要求。群體的觀測雜合度與期望雜合度不存在顯著性差異，表明群體繁育方式合理，多樣性豐富，能夠為動物實驗提供客觀可信數據。PIC是檢測群體多態性的標記值[1]。該群體的平均PIC是0.552(0.3179-0.7874)，PIC>0.5，表明該群體屬于高度多態性群體。與人類群體的遺傳結構特征相似，作為人類疾病的實驗動物模型，能夠較為客觀地提供可比性數據。該群體的香農指數為1.1487(0.6800-1.9223)。香農指數反映了物種的豐富度和相對密度[9]。香農指數越大，表明等位基因分布越均勻。香農指數主要用來衡量遺傳多樣性以及遺傳多樣性的分布情況。有效等位基因數是反映生物群體遺傳變異程度的一個指標,有效等位基因數與觀測等位基因數越接近,說明等位基因在群體中的分布越均勻。通過微衛星技術檢測等位基因數在不同染色體上的分布,從而獲得等位基因的分布情況。該群體的平均有效等位基因數是2.6907(1.5188-5.2301)，觀測等位基因數與有效等位基因數存在顯著性差異，表明該群體等位基因分布不均勻。群體遺傳學中，HWE是最重要的指標。HWE是指等位基因頻率與基因型頻率一致。偏離HWE的起因主要是選擇和非隨機交配。該群體在32個微衛星位點符合HWE，在5個位點偏離HWE。偏離HWE,表明出現近親繁殖，種群分層，基因分型問題等[10]。實驗動物繁育機構應采取必要措施保障群體遺傳結構的穩定。

微衛星標記技術廣泛應用于動物、植物、微生物和細胞的品種品系鑒定，尤其是在實驗小鼠，大鼠，地鼠和小型豬的遺傳質量控制方面有較為廣泛和深入的應用[11]。2017年中國實驗動物學會組織起草并發布實施了團體標準T/CALAS 21-2017小鼠、大鼠微衛星DNA標記檢測方法[12]，標志著我國實驗動物遺傳質量控制手段已逐步實現與國際水平接軌。實驗用貓的遺傳質量控制標準即將發布實施，近交系實驗動物要求個體之間具有基因一致性，封閉群實驗動物要求群體內個體的遺傳多樣性豐富，而作為群體整體的遺傳結構穩定?；⑵へ埲后w的遺傳多樣性分析的相關資料甚少，衣帥等[13]在2013年應用24個微衛星標記對實驗用虎皮貓群體的34只動物進行過遺傳結構分析，本研究保留與2013年研究的相同微衛星位點，比較同一群體，同一組微衛星位點2012年和2017年獲取的遺傳結構數據的差異，進行單因素方差分析，結果顯示該虎皮貓群體的關鍵遺傳多樣性參數雜合度，香農指數，等位基因數均無顯著性差異。表明該虎皮貓群體經過5年的繁育，遺傳結構依然穩定。遺傳漂變是實驗動物飼養繁育過程中必然發生的過程，因此，定期開展遺傳質量檢測工作意義重大。遺傳質量檢測能夠最小化遺傳漂變對實驗動物質量的影響，同時最大化動物實驗結果的可重復性[14-15]。

綜上所述，本研究結果表明微衛星標記技術是一種有效的封閉群實驗動物群體遺傳結構分析手段，本研究成果為我國實驗用貓群體的遺傳質量控制提供檢測方法。實現了我國實驗動物質量檢測水平與國際水平接軌的目的，同時也為實驗用貓群體的開發利用提供保證。