PM2.5暴露對哮喘大鼠氣道形態(tài)及FOXP3基因DNA啟動子區(qū)甲基化影響的實驗研究*

林秀山 周向東 王才春

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內科，海口 570102)

支氣管哮喘是呼吸道常見的慢性疾病，氣道阻力增高以及高反應性是其顯著特征[1-2]。越來越多的循證醫(yī)學證據表明，哮喘發(fā)作與大氣PM2.5濃度有明顯相關關系，這種相關關系的發(fā)生機制十分復雜，表觀遺傳學(甲基化)的變化可能參與其中[3-4]。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(fork head/winged helix transcription factor，FOXP3)是CD+CD25+Treg細胞表面的特異性信號分子，參與調控Treg細胞的形成與功能發(fā)揮[5]，而TH1/TH2功能失衡是哮喘發(fā)病的重要機制，基于以上理論，課題組質疑FOXP3基因的甲基化可能參與了哮喘的發(fā)生以及發(fā)展。因此，本研究選取了50只SD大鼠為研究對象，構建哮喘模型并進行不同濃度PM2.5干預，探討PM2.5暴露對哮喘大鼠氣道形態(tài)及FOXP3基因DNA啟動子區(qū)甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 PM2.5采集與處理

采用大流量顆粒采集裝備，在早高峰及晚高峰時的繁華路口持續(xù)采集24 h。將采樣后的濾膜進行切割、浸水后恒溫振蕩，洗脫后過濾，低溫凍存；在真空中進行冷凍干燥處理，當水分完全蒸干時，容器底部可見呈灰白色絮狀物的PM2.5顆粒。根據實驗設計，采用生理鹽水將PM2.5顆粒配置成1、5、25 mg/mL的懸浮液，現配現用。

1.2 實驗動物模型建立及分組

50只SPF雄性SD大鼠(4～6周齡)，體質量(203±15)g，購于四川大學實驗動物實驗中心，動物生產許可證號為SCXK(川)2013-026。根據干預措施及劑量的不同，將大鼠分為(1)對照組：給予與致敏劑同等劑量的生理鹽水進行腹腔注射。(2)哮喘組：在實驗的第1天，在大鼠大腿內側皮下注射OVA懸液1 mL(卵清蛋白10 mg、氫氧化鋁200 mg)進行致敏，同時腹腔注射百日咳桿菌懸液1 mL作為佐劑，在第8天、第15天各重復一次。大鼠出現典型激惹癥狀及肺組織出現大量炎性細胞浸潤視為造模成功。(3)低劑量組：致敏方法同哮喘組。氣管滴注PM2.5顆粒物懸液1.5 mg/kg體質量，3 d/次，共5次。(4)中劑量組：致敏方法同哮喘組。氣管滴注PM2.5顆粒物懸液6 mg/kg，3 d/次，共5次。(5)高劑量組：致敏方法同哮喘組。氣管滴注PM2.5顆粒物懸液24 mg/Kg，3 d/次，共5次。

1.3 肺泡灌洗液收集及肺組織切片

對大鼠進行動脈采血后處死，仰臥固定四肢，暴露胸腔，游離結扎左主支氣管，在環(huán)狀軟骨上方向右支氣管插入注射器，注射5 mL生理鹽水，灌洗2次，收集約10 mL灌洗液。低溫保存，2000 r/min離心15 min，收集上清，低溫凍存。對離心后的沉淀進行重懸、稀釋，在顯微鏡下用細胞計數板進行細胞總數計算。細胞沉淀涂片，干燥固定，染色后計數200個白細胞進行分類計算。處死大鼠并收集灌洗液后，取左肺下葉，用甲醛固定24 h后，石蠟包埋，切片約5 μm，進行HE染色。

1.4 RT-qPCR檢測

采用TRlzol法提取肺組織中的RNA，采用β-action作為內參基因，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，利用SYBGGreen試劑盒進行RT-PCR反應。引物序列如下，

正向：GGCAAACGGAGTCTGCAAG，

反向：TGCTCCAGAGACTGCACCAC。

反應條件為，50 ℃ 2min，95 ℃變性15 s、30 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。基因相對表達水平采用2-△△Ct法確定。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化

隨著實驗的延長，實驗組大鼠攝食量減少，體質量增長速度減緩，毛發(fā)干枯豎立、無光澤，煩躁不安，易激惹，被激惹時有頻繁點頭、端坐呼吸等表現。與對照組相比，所有實驗組大鼠的體質量均明顯較低(P<0.05)，與哮喘組相比，低、中、高劑量干預組的體質量均明顯較低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體質量變化

2.2 各組大鼠臟器系數比較

5組大鼠的左肺指數、心臟指數、脾臟指數均存在明顯差異(P<0.05)，兩兩比較后發(fā)現，低、中、高劑量干預組的左肺指數及心臟指數顯著高于對照組(P<0.05)，但脾臟指數與對照組及哮喘組無明顯差異(P>0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液細胞計數比較

與對照組比，哮喘組的細胞總數升高顯著，低、中劑量干預組明顯升高(P<0.05)，高劑量干預組無明顯變化(P>0.05)。與對照組及哮喘組比較，隨著PM2.5干預劑量的升高，大鼠BALF內的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞計數呈逐漸上升趨勢，巨噬細胞呈逐漸下降趨勢，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠臟器系數比較

表3 各組大鼠肺泡灌洗液細胞計數比較

2.4 各組大鼠肺組織HE染色

與對照組相比，哮喘組大鼠肺組織有明顯的炎性細胞浸潤，氣道壁增厚。低劑量組炎癥反應進一步加劇，并出現肺泡間隔斷裂，正常結構破壞。中劑量組管腔內分泌物進一步增多，肺泡結構紊亂。高劑量組出現大量杯狀細胞增生，正常肺泡結構少見，支氣管上皮皺襞有斷裂的趨勢，少量細胞出現壞死，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色

2.5 FOXP3基因DNA啟動子區(qū)甲基化及FOXP3 mRNA檢測結果

將陽性對照標準品進行對倍稀釋，對濃度取對數后作X軸，CT值為Y軸，可得FOXP3基因陽性對照標準曲線y=-1.39ln(x)+28.37=5,R2=0.996。結果發(fā)現，對照組、哮喘組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的FOXP3基因DNA啟動子區(qū)的甲基化水平分別為(7.24±0.91)、(5.04±3.08)、(1.87±1.46)、(1.57±0.64)、(2.04±1.14)，FOXP3 mRNA相對表達量分別為(1.02±0.18)、(0.81±0.19)、(0.62±0.15)、(0.53±0.14)、(0.32±0.04)，隨著PM2.5干預劑量的提高，大鼠的FOXP3基因DNA啟動子區(qū)的甲基化水平及FOXP3 mRNA相對表達量均逐漸降低。

3 討論

PM2.5是指環(huán)境空氣中直徑≤2.5 μm的細小顆粒物，它能長時間在空氣中懸浮，雖然在大氣成分中含量很少，但會顯著影響空氣質量和能見度，且PM2.5顆粒徑小，相對面積大，易附帶有毒有害物質，對人體健康會造成明顯的不良影響[6]。我國罹患哮喘的人口基數大，相關的醫(yī)療負擔十分沉重[7]。其發(fā)病機制復雜，環(huán)境因素、遺傳因素、生活習慣因素都參與了其中。PM2.5可明顯促進哮喘等呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展，TH1/TH2功能失衡是重要機制，而FOXP3是調控Treg 細胞發(fā)育及啟動抑制功能的關鍵基因，在近年來的研究中越來越受到重視[8-9]。

在本研究中，我們通過OVA懸液激發(fā)建立大鼠哮喘模型，隨著實驗的延長，大鼠攝食量減少，體質量增長速度減緩，毛發(fā)干枯豎立、無光澤，煩躁不安，易激惹，被激惹時有頻繁點頭、端坐呼吸等表現，與文獻報道一致[10-11]。進一步行收集大鼠肺泡灌洗液，進行細胞計數后發(fā)現，哮喘組的細胞總數升高最顯著，但高劑量干預組無明顯變化。隨著PM2.5干預劑量的升高，大鼠BALF內的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞計數也呈逐漸上升趨勢，巨噬細胞呈逐漸下降趨勢。這表明大鼠哮喘模型建立成功。

Treg細胞分為天然型(nTreg)和誘導型(iTreg)兩大類，參與調控免疫反應，對及時調整過度免疫反應、炎癥反應起著關鍵作用[12]。FOXP3是CD+CD25+Treg細胞表面的特異性信號分子，參與調控Treg細胞的形成與功能發(fā)揮，對哮喘炎癥有明顯的緩解作用[13-14]。Coman等[15]將Treg細胞導入哮喘大鼠模型后，對肺組織進行染色后發(fā)現，嗜酸性粒細胞比例及TH2型細胞因子分泌量均顯著下降，羅征秀等[16]報道稱，與正常兒童相比，哮喘患兒痰液中的FOXP3+Treg 細胞比例明顯降低。在本研究中，我們采用敏感度較高的PCR法檢測了肺組織中FOXP3基因DNA啟動子區(qū)甲基化及FOXP3 mRNA水平，結果發(fā)現，隨著PM2.5干預劑量的提高，大鼠的FOXP3基因DNA啟動子區(qū)的甲基化水平及FOXP3 mRNA相對表達量均逐漸降低。這表明，FOXP3基因啟動子區(qū)的甲基化程度隨著病情程度的加重，呈逐漸降低趨勢，但相對而言，FOXP3 mRNA的表達水平受影響程度較小。我們推測，可能的原因有：(1)FOXP3的轉錄調控機制復雜，可能還受其他信號通路的影響。(2)本研究為動物實驗，與人類基因研究存在種屬差異性。(3)本研究中的甲基化引物是根據基因啟動子區(qū)位點設計的，不能完全排除此位點的特異性。但實驗中FOXP3基因的總體變化趨勢與預想一致，表明隨著哮喘的加重，FOXP3的基因表達量會受到明顯抑制，這與其他研究者的結論相同。

綜上所述，本研究發(fā)現，PM2.5對哮喘大鼠的損傷有一定的劑量依賴性，這可能與調低基因FOXP3基因DNA 啟動子區(qū)甲基化水平及FOXP3 mRNA相對表達量有關。