分子蒸餾技術純化生物轉化2-苯乙醇的工藝優化

劉 蘭，熊大維，李 鵬，黃筱萍

(江西省科學院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

2-苯乙醇(2-Phenylethanol，2-PE)是一種具有玫瑰香味的芳香醇，天然存在于玫瑰油、橙花油、香葉油等芳香油中，因它具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣，而廣泛用于各種食品、醫藥、化妝品、煙草、造紙等行業日化產品中，是配制玫瑰香型食品添加劑，玫瑰香型香精的主要原料[1-2]。并且具有廣譜抗菌作用，可抑制多種細菌和真菌，尤其是果蔬致腐真菌的生長，可作為新型生物保鮮劑應用于食品保鮮中[3-4]。利用酵母生長細胞催化L-苯丙氨酸(L-Phe)轉化合成2-PE，代謝過程中會生成雜酸(如丁酸、戊酸、異戊酸等)、雜醇(丁醇、異戊醇等)副產物，且培養基組分復雜(含大量糖、蛋白質、核酸等)，在產品的分離純化如精餾過程中會增加產物提純的難度，異味物質也會破壞2-PE的原始香氣成分而影響產品品質[5-6]。采用酵母靜息細胞作為酶的載體，反應液組分非常簡單，除底物和少量輔助底物外，無其他有機碳、氮源，副產物少，有利于產品分離純化[7-9]。

生物轉化法合成2-PE的提取方法主要有有機溶劑萃取法、吸附分離法、滲透萃取法和全蒸發法[10]。有機溶劑液-液萃取法通常采用醇類、烴類等化合物進行萃取，再通過蒸餾獲得2-PE，其優點是提取量較大，操作比較簡便，但存在溶劑殘留和精制成本高的缺點[11-12]。

吸附分離法是利用樹脂吸附分離法可以配合發酵過程中的產物原位分離技術原理，將達到一定濃度的2-PE及時從發酵液中移走，從而最大限度降低2-PE的產物抑制作用，大幅提高2-PE的總產量，再用有機溶劑將吸附于樹脂上的產品洗脫[13-14]。滲透萃取法萃取能力較強，但操作復雜，僅適合于小批量的2-PE提取和實驗室應用技術[15]。全蒸發法主要用于較低濃度產品的富集。目前2-PE產品精制主要采用精餾分離，田勛[16]采用雙塔精制獲得了高純度的產品，由于2-PE沸點高，需在極低的壓力下完成精餾操作，操作條件嚴苛。且發酵液中存在與2-PE沸點相近(如苯乙醛等)的副產物，產物不易與之分離。分子蒸餾是一種高真空下的液-液分離技術，通過不同物質分子運動平均自由程的差別實現分離。當蒸汽分子的平均自由程大于蒸發表面與冷凝表面之間的距離，利用料液中各組分蒸發速率的差異，對液體混合物進行分離[17-20]。本研究以酵母靜息細胞轉化合成的2-PE為原料，采用大孔樹脂對2-PE選擇性吸附，乙醇洗脫，洗脫液通過減壓濃縮，再經過二級分子蒸餾精制2-PE，獲得合格產品，為工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料 酵母靜息細胞生物轉化合成2-苯乙醇：本實驗室生產；食品級乙醇(96%)：南昌南翔化工有限公司；2-苯乙醇標準品(99.5%)：Sigma公司；甲醇：默克股份兩會公司；卡爾費休試劑：天津賽孚瑞科技有限公司；HZ-816大孔樹脂：上海華震科技有限公司；超純水自制，其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器 7890B氣相色譜儀(FID檢測器，DB-WAX毛細管柱30 m×0.53 mm×1.0 μm)：美國Agilent公司；870KF水份分析儀：瑞士萬通中國有限公司；Practum 224-1CN分析天平：Sartorius科學儀器北京有限公司；RE5298A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；VKL 70-5-WRS-T型刮膜短程蒸餾設備：德國VTA公司。

1.2 方法

1.2.1 產物的洗脫和收集 吸附在樹脂柱中的2-PE用2.0～2.5倍樹脂柱體積的96%乙醇洗脫，洗脫流速為3.0～4.5 m3/(m3·h)，得到約1.5倍樹脂體積的含2-PE的洗脫液。

1.2.2 旋轉薄膜減壓蒸餾濃縮2-PE條件 含2-PE樹脂洗脫液通過減壓蒸餾回收乙醇，蒸餾溫度50～60 ℃、壓力在50～200 mbar，測定輕重組分中的2-PE含量，計算2-PE濃縮收率。

1.2.3 分子蒸餾工藝條件 2-PE粗提液從加料器進入短程蒸餾裝置，在刮膜器的作用下，從進料器計量泵入分子蒸餾裝置，均勻分布于蒸發器表面上，蒸發器表面溫度由傳熱油精確控制。在高真空條件下，輕組分以氣態徑直飛向中間冷凝器并冷凝成液體，沿著冷凝器流入輕組分收集瓶中。重組分沿著內壁進入重餾分收集瓶中，然后重餾分再次通過蒸餾分離出產品。為了防止揮發物進入真空系統，須在冷阱中加入液氮作為深冷劑。刮膜系統可以保證整個蒸發面上液膜的均勻性，液膜表面不斷被更新，從而確保了被加熱原料在蒸發面上的停留時間。一級分子蒸餾是去除乙醇和水等低沸物，收集重組分；二級分子蒸餾是將重組分重新進行蒸餾，收集輕組分2-PE產品，采用氣相色譜分析樣品及產品中2-PE和乙醇的含量。

1)一級分子蒸餾。物料：2-PE濃縮液，其中2-PE含量892 g/L，乙醇含量40～120 g/L，H2O 1.66%；考察在刮膜轉速350 r/min、進料速率4.0 mL/min條件下，溫度分別為70 ℃、75 ℃時，不同蒸餾壓力(200 mbar、250 mbar、300 mbar、350 mbar、400 mbar)對脫醇效果和蒸餾效率的影響。另外考察了在蒸餾溫度70 ℃、刮膜轉速350 r/min，蒸餾壓力300 mbar時，不同的進料流速(2.0 mL/min、4.0 mL/min、6.0 mL/min)對脫醇效果和蒸餾效率的影響。一級分子蒸餾的輕組分可以合并至下批次的物料中進行重新分離，重組分作為二級蒸餾的原料進行產品分離。

2)二級分子蒸餾。在刮膜轉速350 r/min、進料速率2.0 mL/min條件下，考察溫度分別在120 ℃、125 ℃時，蒸餾壓力為10 mbar、20 mbar、30 mbar、40 mbar、50 mbar的蒸餾效率和產品色度。在刮膜轉速為300 r/min，溫度120 ℃，蒸餾壓力30 mbar條件下，考察進料速率分別為2.0 mL/min、4.0 mL/min、6.0 mL/min、8.0 mL/min、10.0 mL/min、12.0 mL/min對蒸餾效率和產品質量的影響。在進料速率分別為3.0 mL/min，溫度120 ℃，蒸餾壓力30 mbar條件下，考察刮膜轉速分別為100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min、350 r/min、400 r/min對蒸餾效率和產品質量的影響。

1.2.4 GC法測定2-PE和乙醇含量 取適量樣品，用色譜純丙酮稀釋、混勻，0.22 μm聚醚油性濾膜過濾后進樣。色譜柱：Agilent DB-WAX彈性石英毛細管柱(30 m×0.53 mm×1.0 μm)；載氣：99.999%高純氮氣，流速為5 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，進樣器溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，FID檢測器。升溫程序：80 ℃(2 min)→升溫速率(20 ℃/min)→220 ℃(3 min)；進樣方式：分流進樣，分流比10:1；進樣量1 μL。

1.3 數據處理

采用Excel軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 樹脂柱中2-PE的洗脫

生物轉化液中的2-PE經HZ-816大孔樹脂吸附，當流出液中有2-PE時切換樹脂柱，將吸附飽和的樹脂柱(樹脂裝柱體積為7.3 L，HZ816大孔樹脂濕視密度為0.65～0.75 g/mL，范圍粒度為0.315～1.25 mm，先用約1.5～2倍樹脂體積的純水置換樹脂柱中的轉化液，主要去除殘留在樹脂柱中的轉化液底物L-苯丙氨酸，再用約1.5倍樹脂體積96%乙醇溶液進行洗脫。洗脫流速為1.0～2.5 m3/(m3·h)，收集含2-PE的乙醇洗脫液，不含2-PE的乙醇溶液合并其他脫醇液進行乙醇回收，回收的乙醇用于下一批次的使用。圖1為乙醇在洗脫流速為1.5 m3/(m3·h)動態洗脫2-PE濃度變化。

圖1 在不同的空間流速下乙醇動態洗脫2-PE濃度變化

在不同的洗脫流速下所需的乙醇量均為樹脂量體積的1.5～2.0倍之間，洗脫流速為1.5 m3/(m3·h)時2-PE出峰更加集中，洗脫的乙醇量也略低，洗脫效果更佳，因此選擇1.0～2.0 m3/(m3·h)的洗脫流速較為合適。

2.2 2-PE濃縮

將收集的含2-PE洗脫液置于薄膜旋轉蒸發器中進行減壓蒸餾，去除溶劑乙醇和水，濃縮產物。蒸發條件為溫度60～75 ℃，蒸發壓力為10～40 kPa。測定餾出液和濃縮液中的2-PE含量，計算收率。表 1為不同批次2-PE收率變化。

表1 減壓蒸餾制備2-PE濃縮液的物料組成和收率

通過旋蒸濃縮乙醇洗脫液，可獲得2-PE濃度為88%～92%的濃縮液，濃縮液呈深棕色，2-PE濃縮收率可達98%以上。

表2表明，3批次乙醇回收率在95%左右，可能會有少量乙醇隨真空排出了系統，可通過控制真空度和冷凝溫度減少乙醇的損失。

表2 減壓蒸餾回收乙醇收率

2.3 一級蒸餾工藝條件

2.3.1 一級蒸餾溫度和壓力對除乙醇效果的影響 通過二級分子蒸餾對2-PE產品進行精制。一級分子蒸餾的目的是去除乙醇和水等低沸物，二級分子蒸餾的目的是獲得2-PE產品。在進料速率為4.0 mL/min，刮膜轉速為300 r/min，蒸餾溫度分別為70 ℃和75 ℃時，在不同蒸餾壓力條件下的脫醇效果和蒸餾效率(圖2)。所用原料2-PE濃縮液，其組分2-PE為850～920 g/L，H2O為0.1%～0.6%，乙醇為10～50 g/L。

圖2 不同溫度和系統壓力下重組分中乙醇濃度和分離效率

重組分中乙醇濃度越低，乙醇去除效果越好；重組分：輕組分(w/w)比值越高，分離效率越高。在同一蒸餾溫度下，提高蒸餾壓力，不利于分離乙醇，但蒸餾效率明顯提高；在相同的壓力下，提高蒸餾溫度有利于去除乙醇，但蒸餾效率有所下降，綜合乙醇去除效果和分離效率，較佳的操作條件為蒸餾溫度70 ℃、蒸餾壓力為250～300 mbar。

2.3.2 進料速率對脫醇效果的影響 在70 ℃、蒸餾壓力為250 mbar、300 mbar條件下，進料速率分別為2.0 mL/min、4.0 mL/min、6.0 mL/min進行蒸餾，考察不同進料速率對脫醇效果的影響，結果見表3。

表3 一級分子蒸餾進料速率對脫醇效果的影響

隨著進料流速的降低，重組分與輕組分的比例下降顯著，重組分中的2-PE收率略有下降。進料速率對乙醇分離效果影響不顯著，但對2-PE蒸餾效率影響較為明顯，因此選用進料流量為4.0 mL/min比較適宜。

2.4 二級分子蒸餾工藝

2.4.1 蒸餾溫度和壓力對2-PE收率和質量的影響 以一級蒸餾的重組分為原料，重新泵入進料器，蒸出的2-PE冷凝在中間冷凝器壁面上，靠重力作用逐漸流入底部的目的組分收集瓶中，未蒸餾出的重組分流入重組分收集瓶中。在蒸餾溫度為120～125 ℃，壓力為10～50 mbar，進料速率為4.0 mL/min，刮膜轉速為350 r/min的條件下進行二級分子蒸餾，結果見表4、圖3。

表4 不同蒸餾條件對產品純度、收率及色度的影響

圖3 二級分子蒸餾溫度和壓力對2-PE純度和收率的影響

在不同蒸餾溫度和壓力下，產品2-PE濃度均可達到985 g/L以上，在同一壓力下，提高溫度有利于2-PE濃度和收率的提高，低壓蒸餾收率較高，但產品色度較深，呈較明顯的淡黃色，隨著壓力的增加，收率略有下降，但產品色度明顯下降。綜合考慮產品收率、濃度和質量，在120 ℃、30 mbar下，2-PE收率達到82.99%，產品濃度和質量亦達到食品添加劑QB/T1782—2014標準。

2.4.2 二級分子蒸餾過程中進料速率和刮膜轉速對產品質量和蒸餾效率的影響 物料在蒸發壁上的停留時間取決于進料速率，在120 ℃、30 mbar，刮膜速率350 r/min下進行不同進料速率對產品蒸餾效率的影響，結果見圖4。

圖4 進料速率和刮膜轉速對2-PE收率的影響

提高進料速率和刮膜轉速均可提高2-PE收率，提高進料速率，產品的色度有所增加，這可能是進料速率大，液膜厚度增加，重組分物質分離效果會有所下降，刮膜的轉速是物料在加熱壁面形成液膜的時間與厚度主要原因之一，而液膜的均一性和厚度會影響蒸發效率、綜合產品質量和設備分離效率。在進料速率為6.0 mL/min、轉速為300 r/min時產品色度合格。優化的二級分子蒸餾條件為：溫度120 ℃、壓力30 mbar，進料速率6.0 mL/min，刮膜轉速350 r/min，在此條件下，2-PE產品純度均達99.0%以上，質量達食品添加劑QB/T1782—2014標準，收率達82.54%。由于一級分子蒸餾輕組分中的2-PE可以通過去除乙醇和水后再次回到一級分子蒸餾操作，即2-PE可以全部回收,因此在分子蒸餾過程中2-PE的收率取決于二級分子蒸餾的收率。由于2-PE濃縮收率可達98%以上，因此2-PE總收率可達80.9%。

3 結論

1)采用乙醇進行動態洗脫2-PE，洗脫流速為1.5 m3/(m3·h)時2-PE效果較佳，其用量為樹脂量體積的1.5～2.0倍。通過薄膜旋轉蒸發減壓蒸餾濃縮洗脫液，可獲得88%～90%的2-PE濃縮液，濃縮液呈深棕色，2-PE收率可達98%以上, 乙醇回收率在95%左右。

2)生物轉化法生產的2-苯乙醇通過二級蒸餾實現產品精制。一級分子蒸餾目的是去除乙醇和水等低沸物，二級分子蒸餾是分離出2-PE產品。確定了分子蒸餾的最佳運行條件，一級蒸餾的工藝條件為蒸餾溫度70 ℃、蒸餾壓力250～300 mbar，進料流量為4.0 mL/min；二級蒸餾的工藝條件為蒸餾溫度120 ℃、蒸餾壓力30 mbar，進料流量為6.0 mL/min；在此條件下產品色度呈淡黃色，2-PE純度達99.0%以上，收率亦達到82.99%，提取精制2-PE的總收率為81.3%。

3)與傳統精餾精制操作條件相比，采用二級分子蒸餾分離純化2-PE，分子蒸餾條件易于控制，蒸餾溫度大大降低，蒸餾效率較高，產品純度和色度均可達到食品添加劑的要求，為生物法轉化合成2-PE的工業化生產提供有效的工藝參數。