利拉魯肽對糖尿病小鼠肝糖異生關鍵酶PEPCK 及G6pase 的表達影響及機制探討

杜國慧劉博偉尹福在齊曦明范冬梅

(1.承德醫學院,河北承德 067000; 2.河北省秦皇島市第一醫院內分泌二科,河北 秦皇島 066000;3.河北省秦皇島市第一醫院中心實驗室,河北秦皇島 066000)

糖尿病作為慢性代謝性疾病,隨其發病率的飆升[1],已越來越受人們的關注,其發病病理生理機制主要表現在胰島素的缺乏和胰島素抵抗兩個方面。 其中肝的胰島素抵抗與2 型糖尿病的發生發展息息相關,肝糖代謝的紊亂主要通過肝糖原合成及糖異生來影響葡萄糖代謝。 CUL4a—DDB1 連接酶復合物是一類E3 泛素連接酶復合物,可以通過對底物進行泛素化修飾,從而改變蛋白功能或促進被修飾蛋白的降解,DNA 損傷結合蛋白1(DDB1)是DDB1- cul4a 連接酶復合物的支架組分[2-4]。

本課題旨在探討GLP-1 受體激動劑利拉魯肽對糖尿病小鼠肝E3 泛素蛋白酶DDB1 及肝糖異生的影響及可能的機制,為 GLP-1 受體激動劑在T2DM 等代謝性疾病治療中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級,雄性 KK-Ay 糖尿病小鼠 10 只,11 ～ 12周,體重為33～35 g;SPF 級,雄性 C57 小鼠 5 只 11～12 周,體重為26～28 g,均購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008],實驗在天津南開大學醫學部免疫實驗組[SYXK(津)2017-00005]進行。 實驗經天津南開大學倫理管理委員會審核(201907-001),對實驗小鼠在實驗過程中的所有處置均按國家《實驗動物管理條例》的規定執行,并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

利拉魯肽注射液購自諾和諾德制藥有限公司;RIPA 裂 解 液、 PMSF、 SDS-PAGE 制 膠 盒、 TBS(20X)、TRIS Base、Glycine、SDS(十二烷基磺酸鈉)、Tween20、脫脂奶粉(Skim Milk)均購自索萊寶科技(Solarbio);BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自中國Beyotime Biotechnology 公司;ECL 顯影液、PVDF 膜購自美國 Millipore 公司; Anti-mouse IgG-HRP antibody、Anti-Rabbit IgG-HRP antibody 購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Anti-IgG-DDB1 antibody購 自 Abcam; Anti-IgG-G6pase antibody、 Anti-IgGPEPCK antibody 購自博奧森( Bioss); Anti-Cryptochrome I/CRY1 Antibody、Anti-FoxO1a Rabbit Monoclonal Antibody 購自博士德;SDS-Loading Buffer(5×)購自北京康潤科技(Genstar);葡萄糖氧化酶試劑盒購自上海榮盛。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

取11～12 周雄性KK-Ay 糖尿病小鼠10 只,單籠飼養于屏障環境,溫度:20℃～22℃,濕度:45%～55%,光照:12 h/12 h 明暗循環,所有小鼠均予以常規飲食。 小鼠適應環境1 周后測量體重(35.04±0.92)g,血糖>13.9 mmol/L 的 KK-Ay 小鼠隨機分為2 組,即利拉魯肽干預組和模型對照組,每組5只。 另取同周齡體重(28.02±2.04)的雄性 C57 小鼠5 只作為正常對照,利拉魯肽干預組每日腹腔注射250 μg/kg利拉魯肽,模型對照組和正常對照組每日腹腔注射等量生理鹽水,給藥時間每日16:00 ～17:00,連續干預8 周。

1.3.2 動物處理與取樣

在處死小鼠前,禁食12 h,對小鼠進行眼眶取血;取出眼眶血放于EP 管中,然后將EP 管置于37℃水浴鍋孵育30 min;3000 r/min 離心10 min;取上清液(即血清)轉移到對應標記新的1.5 mL 離心管中;采用葡萄糖氧化酶法測定血糖。 同時處死小鼠剖腹取小鼠肝組織分裝置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.3 Western blot 檢測

取0.2 g 肝組織,加入提前配好的RIPA 裂解液800 μL(RIPA 裂解液+蛋白酶抑制劑2%+磷酸酶抑制劑1%+PMSF 1%),超聲波裂解肝組織,冰上靜置30 min,12000 r/min 離心 30 min,取上清。 應用BCA 法創建蛋白定量標準曲線,依據定量,計算各肝標本中的總蛋白和蛋白濃度。 應用10% SDSPAGE 分離膠膠對蛋白電泳分離約1.0 ～1.5 h,在冰浴條件下轉膜(濕轉)約120 min。 用5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉2 h。 一抗(依據抗體說明書及摸索的具體情況確定稀釋比例,用1×TBST 稀釋)4℃條件下搖床孵育過夜。 第2 天將PVDF 膜用1×TBST 洗滌5 次,每次6 min,二抗(依據說明書要求的稀釋比例,應用1×TBST 稀釋)室溫孵育2 h,洗滌后在多功能成像儀暗室中曝光、成像、記錄圖像。

1.4 統計學方法

用Image J 軟件測定每個目標條帶的灰度值,使用Graphpad 5.0 進行統計學分析和作圖。 實驗數據用平均數±標準差(±s)表示,組間比較用t檢驗,以P<0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 對隨機血糖的影響

三組小鼠血糖值差異具有統計學意義,模型對照組血糖值(30.84±1.29)mmol/L 較正常對照組血糖值(8.88±0.47)mmol/L 明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01);利拉魯肽干預組血糖值(23.74±2.74)mmol/L 較模型對照組明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 對肝組織E3 泛素蛋白酶DDB1 表達的影響

Western blot 結果顯示糖尿病小鼠肝內E3 泛素蛋白酶DDB1 蛋白水平明顯高于正常對照組(P<0.05),經利拉魯肽干預處理后,糖尿病小鼠肝內DDB1,CRY1 的表達均低于糖尿病對照組(P<0.05),見圖1、表1。

2.3 對小鼠肝組織CRY1、FOXO1, 及糖異生關鍵酶PEPCK、G6pase 表達的影響

Western blot 結果顯示糖尿病小鼠肝內FOXO1,PEPCK 及G6pase 蛋白水平明顯高于正常對照組(P<0.05),經利拉魯肽干預后,糖尿病小鼠肝內FOXO1,PEPCK 及G6pase 的表達均明顯低于模型對照組(P<0.05),見圖2,表2。 糖尿病小鼠內CRY1 蛋白表達水平明顯低于正常對照組(P<0.05),利拉魯肽干預處理后,表達量卻明顯上調(P<0.05),見圖2、表2。

圖1 利拉魯肽對糖尿病小鼠肝E3 泛素蛋白酶DDB1蛋白表達水平的比較Figure 1 Comparison of the expression level of E3 ubiquitin protease DDB1 in liver of diabetic mice with 1iraglutide

3 討論

胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)主要由末端空腸、回腸和結腸中的 L 細胞受到食物刺激后分泌[5],是一種腸內分泌源性肽,通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素釋放、促進β細胞增殖、減少食物攝入等途徑,起到抑制糖尿病的作用[6],現已廣泛應用于臨床,主要用于改善2型糖尿病患者的胰島素敏感性。 各項臨床研究及meta 分析都指出:GLP-1 及其類似物能夠顯著降低2 型糖尿病患者的血糖及體重,改善胰島素的敏感性,可以改善心衰大鼠左心室的收縮和舒張功能袁減輕心肌細胞的損傷,且獨立于降糖機制[7]。 其中利拉魯肽(1iraglutide)屬于長效的 GLP-1 類似物,與人體天然的GLP-1 氨基酸序列具有97%的同源性,于2010 年由美國FDA 批準用于臨床,而目前主要用于改善成人2 型糖尿病患者的血糖控制[8],本次實驗結果提示模型對照組較正常對照組血糖明顯升高,而利拉魯肽干預后,血糖明顯下降,并具有統計學意義。

表1 5 組小鼠肝組織E3 泛素蛋白酶DDB1蛋白表達水平的比較Table 1 Comparison of the expression level of E3 ubiquitin protease DDB1 in liver tissues of five groups

圖2 利拉魯肽對小鼠肝CRY1、FOXO1 及PEPCK、G6pase 蛋白表達水平的影響Figure 2 Effect of Lilarutin on CRY1、FOXO1 and PEPCK、G6pase expression in mouse liver

表2 5 組小鼠肝組織 CRY1、FOXO1、G6pase、PEPCK 蛋白表達水平的比較Table 2 Comparison of protein expression levels of CRY1, FOXO1, G6pase and PEPCK in five groups mouse liver

泛素-蛋白酶體途徑(UPS)是存在于真核細胞中精確調控細胞質和細胞核內蛋白質有序降解的途徑,由泛素(Ub)、 泛素激活酶(E1)、 泛素結合酶(E2)、 泛素連接酶(E3)、26S 蛋白酶體和去泛素化酶(DUBs)組成[9]。 越來越多的研究證據表明E3泛素蛋白酶通過調節胰島素信號傳導中的關鍵分子在胰島素抵抗的發展中起著關鍵作用[10]:MG53的過度表達可以觸發肌肉胰島素抵抗和代謝綜合征[11-12];膜相關環-CH-1(MARCH1)可以通過泛素化負調節胰島素受體的細胞表面水平[13];也有報道稱脂肪組織E3 泛素蛋白酶Pellino3 對胰島素抵抗卻表現出保護作用[14]。 Xin 等人的研究表明,E3 泛素蛋白連接酶DDB1 可能是一種新型的糖原異生監管因素,它主要通過介導CRY1 蛋白的降解,進而推動FOXO1 介導的糖異生作用,同時也證實肝細胞DDB1 缺乏不僅抑制空腹時糖原異生,并且可以保護小鼠免受禁食高脂肪飲食引起的高血糖[15-16]。本研究結果顯示利拉魯肽在肝內可作用于E3 泛素蛋白酶DDB1,并下調它的表達,提示 GLP-1 及其類似物在肝內可能通過下調E3 泛素蛋白酶,進而發揮抑制肝糖異生的作用,而其中的具體作用機制尚有待進一步實驗研究。

肝是糖脂代謝的重要器官,在糖尿病的發生發展中起著至關重要的作用[17]。 在糖尿病患者中,肝糖異生增加導致大量內源性葡萄糖產生,特別是增加了空腹高血糖的發生[18],其中糖異生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)編碼基因的多少是決定糖異生啟動的關鍵環節[19],故通過干預肝糖異生, 減少肝葡萄糖生成, 將為改善肝胰島素抵抗提供一個廣闊前景。而肝糖異生還受很多轉錄因子的調控,包括叉頭盒轉錄因子 O1(FoxO1)、CREB、 PGC-1α 等等,其中FOXO1 被證實是肝用來監測脂質和葡萄糖代謝與循環胰島素水平的傳感器,是肝糖異生關鍵酶調控的上游靶點,主要促進空腹時肝糖異生, 增加肝糖輸出[20-21]。 Fan 等人[22]發現 exendin-4 可增加幼鼠肝AKT 和FOXO1 磷酸化,抑制葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表達。 在本次研究中同樣證實利拉魯肽下調了肝糖異生關鍵酶PEPCK 及G6pase 的表達,糖異生的上游靶點FOXO1 的表達也同樣被下調,推測利拉魯肽抑制肝糖異生可能與部分下調E3 泛素蛋白酶進而抑制FOXO1 有關,而其中的具體機制需要進一步去驗證。

隱花色素1(cryptochrome 1,CRY1)表達蛋白是生物鐘的組成部分,經體液和神經途徑送達效應器,調節生理、生化和節律行為,肝糖異生也受晝夜節律的調控,晝夜節律是協調葡萄糖代謝與外部環境變化,研究發現CRY1 可以通過作用于糖皮質激素受體和胰高血糖素信號通路負調控FOXO1 的表達,抑制肝糖異生[23-25], Stojkovic 等[26]人提出泛素化是一個時鐘蛋白修飾編碼的關鍵因素,本研究發現肝中CRY1 的表達與DDB1 呈負相關,這與之前研究結果是相符的,故推測CRY1 在肝可能是通過泛素蛋白的泛素化來降解的,進而抑制肝糖異生,但其中的具體機制仍需要進一步研究證實。

總之,利拉魯肽降低糖尿病小鼠糖異生關鍵酶PEPCK 及G6pase 的表達,抑制了肝的糖異生,有效控制糖尿病小鼠血糖。 同時利拉魯肽可顯著下調糖尿病小鼠肝內E3 泛素蛋白酶DDB1 的表達水平,揭示了利拉魯肽調節肝糖異生可能存在的一種新的通路,這同時也揭示了E3 泛素蛋白酶可能成為一種新的肝糖異生的負調控因子,有望成為治療2型糖尿病的新的靶點。