賴氨酸—木糖體系美拉德反應產物的優化制備及抑菌性

孫煒煒 蔡 超 段麗萍 陳 勝 陳 浩 金 皓 朱 杰

(1.武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430050；2.武漢黃鶴樓新材料科技開發有限公司，湖北 武漢 430050)

為了防止食物變質，化學合成類防腐劑成為食品中必須添加的成分，但其若在人體內長期積累，則會具有一定的負面影響[1]。目前天然防腐劑主要來自于植物、動物和微生物產生的活性抑菌成分。如，植物源的黃酮類化合物用于水產品的保質、動物源的殼聚糖用于醋腌食品的防腐等[2]。但天然抗菌物質提取、分離純化步驟復雜，技術要求較高等制約了其大規模的商業化應用[3]。

目前，美拉德反應產物(Maillard reaction products，MRPs)已被證實存在良好的抗菌性能[4]。美拉德反應是指氨基酸/蛋白質和還原糖之間發生的一種非酶褐變反應，又稱羰氨反應。大多數食品中都含有羰基(源自糖或油脂氧化酸敗等)和氨基(源自氨基酸、肽和蛋白質等)，因此這類反應普遍存在于食品加工和貯存過程中。MRPs主要包括香味物質、紫外吸收中間體和深棕色高分子化合物類黑素等，其賦予了食物誘人的色澤、濃郁的芳香和醇厚的滋味。但反應控制不當時，可產生一些危害衍生物如丙烯酰胺、雜環胺類、晚期糖基化末端終產物(AGEs，如羧甲基賴氨酸、戊糖苷素、3-脫氧葡萄糖酮酸、吡咯素、吡咯醛、丙酮醛等) 等物質，可引起癌癥及慢性疾病的發生[5](人體動脈粥樣硬化、視網膜病變、神經衰退性疾病及糖尿病等)。已有研究[6-7]表明上述危害衍生物的形成都會受到抗氧化劑成分的抑制作用，主要包括自由基清除、羰基捕獲和金屬離子螯合3種機制。此外，賴氨酸—木糖體系美拉德反應產物(XL-MRPs)存在較強的抗氧化活性[8]。試驗擬以木糖(Xylose)和賴氨酸(Lys)為原料，以抗氧化活性及褐變程度為評價指標，通過分別控制不同變量(反應時間、反應溫度、反應pH和n木糖∶n賴氨酸)進行單因素試驗，再以FRAP為響應值進行試驗條件設計，優化木糖—賴氨酸體系美拉德反應的制備條件，旨在加深對XL-MRPs宏觀特性的理解，并為天然防腐劑的開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木糖(Xylose)：上海山浦化工有限公司；

賴氨酸(Lys)：天津市光復精細化工研究所；

無水醋酸鈉、冰乙酸、鹽酸、硫酸亞鐵、硫酸、碳酸氫鈉、TPTZ、氯化鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用RO水。

1.2 儀器與設備

可見分光光度計：722型，天津冠澤科技有限公司；

分析天平：BS-210型，德國Sartorius Instruments公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：BXM-30R型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

(1) 反應時間對XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys按n木糖∶n賴氨酸=1∶1稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，調節pH至7.0，120 ℃下分別反應0，30，60，90，120，150 min，反應產物于4 ℃冰箱中備用，考察反應時間對褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

(2) 反應溫度對XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys按n木糖∶n賴氨酸=1∶1稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，調節pH至7.0，分別于80，90，100，110，120，130 ℃下反應120 min，考察反應溫度對褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

(3) 反應pH對XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys按n木糖∶n賴氨酸=1∶1稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，分別調節pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，110 ℃反應120 min，考察pH對褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

(4)n木糖∶n賴氨酸對XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys分別按n木糖∶n賴氨酸=1.0∶1.0，1.5∶1.0，2.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，調節pH至9.0，110 ℃反應120 min，考察n木糖∶n賴氨酸對褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

1.3.2 響應面試驗設計 根據響應面法中Box-Behnken設計(BBD)原理，以反應時間、反應溫度、反應pH、n木糖∶n賴氨酸為試驗因素，以FRAP為響應值，設計四因素三水平響應面試驗優化XL-MRPs的制備條件[9]。

1.3.3 XL-MRPs的抑菌性 采用抑菌圈法測定XL-MRPs對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用[10]。

1.3.4 XL-MRPs的抗氧化性能 以FRAP值作為抗氧化性能的考察指標，參照文獻[11]的方法進行測定。

1.3.5 XL-MRPs的褐變程度 采用吸光度法[12]。

1.3.6 數據處理 所有試驗平行3次，結果取平均值。運用Origin 2018、Design Expert 8.0.6軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1可知，當反應時間≤120 min時，XL-MRPs的抗氧化活性及褐變程度均隨反應時間的延長而增大，其中FRAP值由0.23增大至0.73，抗氧化能力提升3倍以上，且反應體系前30 min產生褐變物質的速率最快(斜率最大)；當反應時間>120 min時，隨著反應時間的延長，XL-MRPs的抗氧化活性及褐變程度緩慢減小，說明MRPs中具有抗氧化活性的成分以及褐變物質易于在反應進行的前期階段形成，反應過程中，中間產物經脫氫、縮合、分子重排生成的類黑精和揮發性雜環化合物增多，XL-MRPs的抗氧化活性增強，褐變程度加深；反應后期，這些具有抗氧化活性的物質會繼續反應而損失減少，可能是由于高溫反應時間過長，生成的物質降解導致的[13]。故控制體系反應時間為120 min左右能產生最大的抗氧化能力和褐變程度。當反應溫度由90 ℃升高至110 ℃時，體系褐變程度加深，抗氧化活性增強；當反應溫度繼續升高至130 ℃時，XL-MRPs的褐變值由0.484降至0.308，FRAP值由0.69降至0.32。一般而言，高溫有利于美拉德反應的進行，使得反應體系在較短時間內生成較多的還原酮雜合物和類黑精等化合物，這些物質對MRPs的還原力有重要貢獻，XL-MRPs的抗氧化活性增強；溫度過高會使生成的中間產物發生分解，導致抗氧化活性降低[14]。因此控制體系反應溫度為109 ℃，此時有最大的抗氧化能力和褐變程度。當反應體系初始pH從5.0上升至9.0時，FRAP值及褐變吸光度均逐漸增大，體系抗氧化活性和褐變程度逐步增強，可能是由于參與美拉德反應的是胺離子，反應體系堿性越強，尤其是當pH>7.0時，胺離子的質子被釋放，增加了參與美拉德反應的游離氨基的有效濃度，體系pH增加有利于XL-MRPs的形成，生成的類黑素等化合物含量較高，抗氧化活性增強。因此體系pH為9.0時，褐變程度和抗氧化活性均最大。當增加反應體系中木糖含量時，XL-MRPs的FRAP值及褐變程度均明顯提高；其中，當n木糖∶n賴氨酸為2∶1時，XL-MRPs的FRAP值最高，表現出較強的抗氧化活性，此時體系也有最大的褐變程度。綜上，賴氨酸—木糖體系美拉德反應最佳制備條件為：反應時間120 min，pH 9.0，反應溫度110 ℃，n木糖∶n賴氨酸為2∶1。此外，褐變值和FRAP值總是同時達到最大，且同步增大和減小，表明體系美拉德反應進程中抗氧化產物和形成褐變的物質總是同步產生或損失。

圖1 各因素對XL-MRPs褐變程度和抗氧化活性的影響Figure 1 Effects of different conditions on the browning degree and antioxidant activity of XL-MRPs

2.2 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken中心組合原理對XL-MRPs制備條件進行優化，試驗因素和水平見表1，試驗設計與結果見表2。

利用Design-Expert 11.1.0.1軟件對響應面試驗結果進行回歸分析，得到XL-MRPs的FRAP值與各因素的回歸方程：

Y=1.29+7.285E-003A+0.092B+0.042C+0.13D+0.013AB+0.025AC-0.051AD+0.070BC+0.013BD-0.070CD-0.094A2-0.093B2-0.14C2-0.11D2。

(1)

經響應面分析得XL-MRPs的最佳制備條件為反應時間119.87 min，反應pH 8.97，反應溫度109.49 ℃，n木糖∶n賴氨酸=2.1∶1.0，此條件下XL-MRPs的預測FRAP值為1.32。由于實際操作等因素影響，將最佳制備條件修正為反應時間120 min，反應pH 9.0，反應溫度109 ℃，n木糖∶n賴氨酸=2.1∶1.0，進行驗證實驗(n=3)，得實測FRAP值為(1.33±0.16)，與預測值相符，證明用所建模型預測XL-MRPs的FRAP值是準確可行的。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Experiment design of response surface factor

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experiment design and results of response surface methodology

2.3 XL-MRPs的抑菌性

由表4可知，XL-MRPs對3種供試菌均具有抑菌圈，同濃度下其對大腸桿菌的抑菌圈最大，金黃色葡萄球菌的次之，枯草芽孢桿菌的最小。3種供試菌中，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，說明XL-MRPs對革蘭氏陽性菌及陰性菌均有抑菌作用，且對革蘭氏陰性菌的抑制作用強于陽性。隨著XL-MRPs稀釋梯度的增加，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制能力逐漸增強。當XL-MRPs稀釋至10-6梯度時，產生的抑菌圈直徑均小于抑菌性判斷標準的(7 mm)，說明在此梯度下XL-MRPs沒有抑菌性，故最小抑菌濃度為10-6。

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Regression coefficient and variance analysis

3 結論

以賴氨酸和木糖作為原料制備美拉德反應產物，其最優制備條件為反應溫度109 ℃，反應時間120 min，反應pH 9.0，木糖與賴氨酸摩爾比2.1∶1.0。此條件下木糖—賴氨酸體系美拉德反應產物的抗氧化性最強，FRAP值為1.33±0.16。木糖—賴氨酸體系美拉德反應產物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有抑菌作用，且木糖—賴氨酸體系美拉德反應產物溶液的最小抑菌濃度為10-6。后續擬開展中試論證試驗，設計賴氨酸—木糖美拉德反應產物的規模化生產工藝路線。

表4 XL-MRPs稀釋梯度對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑的影響?Table 4 Effects of different concentration of XL-MRPs on the diameter of inhibition zone of Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis mm