牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶的分離及其酶學(xué)性質(zhì)

趙莉君 趙 珂 趙改名 馬陽陽 朱瑤迪 李苗云 黃明遠(yuǎn)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.舞鋼市防震減災(zāi)中心，河南 舞鋼 462599)

冷鮮牛肉營養(yǎng)豐富，味道鮮美，在滿足人們對美食需求的同時，給人體健康帶來諸多益處，是牛肉消費的主要形式[1-2]。然而，冷鮮牛肉在運輸和貯藏過程中出現(xiàn)的顏色劣變問題極大程度地影響了其銷售，制約了其發(fā)展。研究[3-5]表明，影響冷鮮牛肉色澤穩(wěn)定性的因素包括品種、部位、溫度、pH、脂質(zhì)過氧化、微生物、肌紅蛋白的狀態(tài)及高鐵肌紅蛋白還原酶的活性等。其中，氧合肌紅蛋白呈鮮紅色，高鐵肌紅蛋白呈棕褐色，肌細(xì)胞內(nèi)部存在的高鐵肌紅蛋白還原酶能將高鐵肌紅蛋白還原成氧合肌紅蛋白，從而穩(wěn)定肉色，延長其貨架期[5-7]。就不同部位冷鮮肉而言，貯藏過程中，背最長肌的色澤穩(wěn)定性相對較好。

近年來，有關(guān)高鐵肌紅蛋白還原酶的研究報道較多，但涉及其分離純化和性質(zhì)研究的相對較少。研究[8-10]表明，不同種類的肉、同一種類不同部位的肉，高鐵肌紅蛋白還原酶間存在差異。試驗擬以冷鮮牛背最長肌為原料，采用硫酸銨鹽析、超濾的方法，對其高鐵肌紅蛋白還原酶進(jìn)行粗分離，并對高鐵肌紅蛋白還原酶的適宜溫度、pH等進(jìn)行研究，以期為冷鮮牛肉色澤穩(wěn)定性的提高提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛背最長肌：夏南牛，鄭州市天明路黃家牛肉超市；

透析袋：截留分子量10 kDa，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；

超濾膜：分子量50，30，10 kDa，上海摩速科學(xué)器材有限公司；

馬骨骼肌肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司；

硫酸銨、磷酸、鐵氰化鉀等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：AL104型，梅特勒—托利多(上海)有限公司；

臺式冷凍離心機(jī)：Multifuge X1R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-601A型，金壇市國旺實驗儀器廠；

超濾杯：MILLIPORE 8050型，上海摩速科學(xué)器材有限公司；

磁力攪拌器：JB-1A型，上海雷磁儀器廠；

電泳儀：DYY-5型，北京六一儀器廠；

紫外檢測儀：HD-21-2型，上海青浦滬西儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 高鐵肌紅蛋白還原酶粗酶液的提取 參照高娜等[11-12]的方法并稍作改進(jìn)。肉樣切小塊去筋膜，攪碎。每組取5 g樣品并加入20 mL磷酸緩沖液。經(jīng)高速分散器勻漿處理后，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液用中速定性濾紙過濾掉多余脂肪。用稍過量的鐵氰化鉀(3.0 mmol/L)氧化濾液中的氧合肌紅蛋白，至濾液由鮮紅色變?yōu)楹稚V液裝入分子量10 kDa 的透析袋，于磷酸緩沖液中透析除鹽24 h(每5 h換一次透析液)，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，取上清液，用磷酸緩沖液定容至25 mL，即制得粗酶液。

1.2.2 高鐵肌紅蛋白還原酶酶活性的測定 參照文獻(xiàn)[6,11-12]的方法并稍作改進(jìn)。反應(yīng)溫度25 ℃，反應(yīng)前25 min將各組分放置于25 ℃水浴鍋中水浴加熱。加入還原型輔酶Ⅰ后，啟動反應(yīng)，測定580 nm處吸光值，每隔10 s記錄一次數(shù)據(jù)。

1.2.3 硫酸銨鹽析 參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作改進(jìn)。取粗酶液，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至55%飽和度，磁力攪拌20 min，冰浴靜置2 h，4 ℃、10 000 r/min離心20 min；取上清液，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至60%飽和度，重復(fù)上述操作，最終得到粗酶液在55%，60%，65%，70%的硫酸銨飽和度下的分級沉淀物；將沉淀分別溶于磷酸緩沖液，于4 ℃充分透析脫鹽，測定蛋白含量和高鐵肌紅蛋白還原酶酶活。

1.2.4 超濾 參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作改進(jìn)。在1.2.3的基礎(chǔ)上，將具有高活性高鐵肌紅蛋白酶活的目標(biāo)樣液用微孔濾膜(0.45 μm)過濾去除不溶性雜質(zhì)，將濾液加冰磷酸鹽緩沖液(2.0 mmol/L，pH 7.0)稀釋，于氮氣壓力1.0 MPa，120 r/min下分別用50，30，10 kDa膜進(jìn)行超濾，測定蛋白含量和高鐵肌紅蛋白還原酶酶活。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定 采用Bradford法[13]。取5 mL 過濾后的考馬斯亮藍(lán)染液，加入待測樣液1 mL，5 min 后測定595 nm處吸光度，并將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)濃度。

1.2.6 SDS-PAGE電泳 參照SDS-PAGE電泳標(biāo)準(zhǔn)操作流程[13]。其中，使用5%濃縮膠和12%分離膠，Marker的分子量為6.5～200.0 kDa，對MetMbR酶的粗提取液及各純化階段酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗。

1.2.7 適宜溫度、pH等的測定

(1) 最適溫度：按1.2.2的方法將整個反應(yīng)體系組分分別置于20，30，40，50 ℃下反應(yīng)，測定高鐵肌紅蛋白還原酶活性。

(2) 最適pH：按1.2.2的方法將整個反應(yīng)體系組分分別于pH 5.0，6.0，7.0，8.0下反應(yīng)，測定高鐵肌紅蛋白還原酶活性活。

(3) 金屬離子：按1.2.2的方法在反應(yīng)體系中分別以不同離子濃度(0.5，1.0，5.0 mmol/L)的Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+金屬離子替代EDTA，同時以去離子水作為空白對照，測定不同金屬離子下高鐵肌紅蛋白還原酶活性變化。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010和SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶的粗分離

2.1.1 硫酸銨鹽析 夏南牛牛背最長肌粗酶液中高鐵肌紅蛋白還原酶的酶活為(89.0±1.4) U/mL。硫酸銨鹽析法常用來進(jìn)行酶的粗分離，其操作簡便，效果好[14]。由表1 可知，當(dāng)硫酸銨飽和度為65%時，高鐵肌紅蛋白還原酶活性較高，即當(dāng)硫酸銨飽和度為65%時，可主要沉淀得到高鐵肌紅蛋白還原酶，實現(xiàn)粗分離。

2.1.2 超濾 超濾是常用的膜分離技術(shù)之一，其以壓差為推動力，根據(jù)超濾膜截留分子量的不同，可用于對酶的粗分離與純化[15]。由表2可知，>50 kDa超濾膜截留液中所獲得的高鐵肌紅蛋白還原酶活性較高，可取該部分經(jīng)粗分離與純化的截留液進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 不同硫酸銨飽和度下牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶酶活Table 1 The metmyoglobin reductase activity of longissimus muscle under different ammonium sulfate saturation

由表3可知，牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶經(jīng)硫酸銨鹽析、超濾后，得到了一定程度的粗分離與純化。

2.1.3 SDS-PAGE電泳 由圖1可知，牛背最長肌粗酶液中的蛋白分子量為14.3～97.2 kDa，經(jīng)硫酸銨鹽析、超濾初分離后，提取物中的蛋白分子量為29.0～66.4 kDa。經(jīng)硫酸銨鹽析、超濾后，牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶雖得到了部分分離與純化，但粗酶液中還含有大量其他雜蛋白。若需對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分離與純化，還需通過凝膠過濾層析或離子交換層析、親和層析等技術(shù)得以實現(xiàn)[16-17]。

表2 不同超濾截留液中牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶酶活Table 2 The metmyoglobin reductase activity of longissimus muscle under different ultrafiltration

表3 分步提取物中牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶酶活Table 3 The metmyoglobin reductase activity of longissimus muscle under different purification

M.Marker 1.粗酶液 2.65%硫酸銨鹽析 3.>50 kDa超濾圖1 SDS-PAGE電泳圖Figure 1 SDS-PAGE electrophoretogram

2.2 牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適溫度 由表4可知，溫度對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性影響顯著(P<0.05)，隨著溫度的升高，牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性先上升后下降。當(dāng)溫度為40 ℃時，牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性最高。Mikkelsen等[18]發(fā)現(xiàn)牛心肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性隨溫度的升高而升高，直至溫度為30 ℃；Eehevarne等[19]發(fā)現(xiàn)牛骨骼肌高鐵肌紅蛋白還原酶最適溫度為37.5 ℃，且當(dāng)溫度為10 ℃以下和50 ℃以上時活性極小。綜上，溫度對高鐵肌紅蛋白還原酶活性有較大影響。

2.2.2 最適pH 由表5可知，pH對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性影響顯著(P<0.05)，牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性的適宜pH為6.0。Hagler等[8]發(fā)現(xiàn)牛心肌中MetMbR的最適pH為6.5，高娜等[11]研究表明牦牛背最長肌在pH 7.0時MetMbR酶活最高，Zhu等[20]也發(fā)現(xiàn)pH值對MetMbR的還原作用影響顯著。

表4 溫度對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶酶活的影響?Table 4 Effect of temperature on the metmyoglobin reductase activity

表5 pH對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶酶活的影響?Table 5 Effect of pH on the metmyoglobin reductase activity

2.2.3 金屬離子 由表6可知，5種金屬離子(Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+)對高鐵肌紅蛋白還原酶酶活呈抑制作用，其中Cu2+的抑制作用尤為明顯，與王瑋[9]的研究結(jié)論一致。

表6 金屬離子對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶酶活的影響?Table 6 Effect of metal ions on the metmyoglobin reductase activity

3 結(jié)論

對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶進(jìn)行了粗分離。結(jié)果表明，牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶酶活為89.0 U/mL。經(jīng)硫酸銨鹽析(硫酸銨飽和度為65%)、超濾(>50 kDa)，可使得牛背最長肌中高鐵肌紅蛋白還原酶實現(xiàn)粗分離。SDS-PAGE電泳表明，牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶的純化效果并不理想，若要得到電泳純的高鐵肌紅蛋白還原酶，還需在后續(xù)研究中通過凝膠過濾層析、離子交換層析或親和層析等技術(shù)實現(xiàn)。粗分離所得的牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶分子量為29.0～66.4 kDa，最適溫度為40 ℃，最適pH為6.0。此外，金屬離子(Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+)對牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性有抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最明顯。