一種多菌靈酶聯免疫快速檢測方法的建立

蔣文慧 吳小勝 崔 娜 張 瑜 彭正學 崔海峰 萬宇平

(1.浙江省杭州市人民檢察院，浙江 杭州 310012；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206；4.北京望爾生物技術有限公司，北京 102206)

多菌靈(carbendazim)即N-(2-苯并吡唑基)氨基甲酸甲酯，屬于苯并吡唑類，是一種病害防治殺菌劑，被廣泛應用于農作物。然而施用多菌靈的目標物會長期殘留該藥物，人、畜食用后，會引起頭暈、惡心、嘔吐、抽搐等一系列中毒癥狀[1-2]。

GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定了果蔬、茶葉中多菌靈的最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)范圍為：0.02～5.00 mg/kg。目前中國的檢測標準有：GB/T 5009.188—2003《蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測定》、GB/T 23380—2009《水果、蔬菜中多菌靈殘留的測定 高效液相色譜法》、SN/T 3650—2013《藥用植物中多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈殘留量的測定 液相色譜—質譜/質譜法》、SN/T 0162—2011《出口水果中甲基硫菌靈、硫菌靈、多菌靈、苯菌靈、噻菌靈殘留量的檢測方法 高效液相色譜法》、SN/T 1753—2016《出口濃縮果汁中甲基硫菌靈、噻菌靈、多菌靈和2-氨基苯并咪唑殘留量的測定 液相色譜—質譜/質譜法》、SN/T 0220—2016《出口水果中多菌靈殘留量的檢測方法》、NY/T 1680—2009《蔬菜水果中多菌靈等4種苯并咪唑類農藥殘留量的測定 高效液相色譜法》、NY/T 1453—2007《蔬菜及水果中多菌靈等16種農藥殘留測定 液相色譜—質譜—質譜聯用法》。上述標準均為儀器分析法，同時，通過查閱文獻發現，前人研究多菌靈檢測方法較多地偏重儀器方法，已報道的儀器方法有：超高效液相色譜法[3]、QuEChERS—高效液相色譜法[4-5]、液相色譜—質譜/質譜法[6]、紫外分光光度法[7]、液相色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]、SERS法[12]等，分析對象主要為蔬菜、水果。此外，也有報道[13-14]利用酶聯免疫法快速檢測多菌靈的殘留量，但分析對象為土壤和水，目前尚未檢索到農產品中檢測多菌靈殘留量的快速檢測方法。而且儀器分析法成本高、步驟復雜，對檢測人員有較高的技術要求，不便于基層實驗室和中小型生產企業實施檢測。因此，研究擬采用酶聯免疫吸附法對煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留量進行檢測，以期提供一種成本低、效果好的方法，為農藥殘留監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多菌靈、噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑標準品：純度≥95%，北京標準物質研究中心；

牛血清白蛋白：純度≥98%，美國Sigma公司；

卵清蛋白：純度≥98%，美國Sigma公司；

三氟乙酸、三氟乙酸酐、硝酸銨、氫氧化鈉、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化錫、碳二亞胺、石油醚、硫化銨、二甲基甲酰胺、碳酸鉀：分析純，北京百欣試劑公司；

果蔬、茶葉、煙葉：市售；

Balb/c小鼠：斯貝福(北京)生物技術有限公司；

單克隆雜交瘤細胞株：實驗室自制；

酶標儀：MK3型，上海雷勃分析儀器有限公司。

1.2 抗原制備

1.2.1 半抗原制備 取三氟乙酸20 mL，加三氟乙酸酐2 mL，冰水浴至0 ℃，加硝酸銨0.5 g，攪拌1 h，加入含多菌靈1.0 g的三氟乙酸溶液，繼續攪拌反應2 h。停止攪拌，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，加200 mL二氯甲烷萃取，加水300 mL，充分攪拌，轉入分液漏斗中，靜置30 min，分層，分去上層水相，所得二氯甲烷溶液，旋蒸(40 ℃)，50 mL乙醚打漿，得到化合物a 0.76 g，收率67%[15]。在上述三氟乙酸和三氟乙酸酐體系下，用硝酸銨對多菌靈進行硝化反應，在苯環上引入硝基，萃取前進行中和，便于萃取。1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ：8.31(1H，dd，J=1.616，J=1.239)，7.69(1H，dd，J=8.716，J=1.616)，7.64(1H，dd，J=8.716，J=1.239)，3.85(3H，s)。

取化合物a 0.7 g用乙醇溶解，加含0.43 g氯化錫的水溶液10 mL，通入氮氣，加熱回流反應3 h；旋蒸(60 ℃)、除去乙醇，加水200 mL，加乙酸乙酯100 mL，充分攪拌，靜置，分去水相，有機相旋蒸(55 ℃)以除去大部分乙酸乙酯，利用石油醚—乙酸乙酯(V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶1)對其進行洗脫分離，得到b產物(半抗原化合物)0.54 g，收率為83%。1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ：3.79(3H，s)，6.27(2H，s)，6.90(1H，dd，J=2.225，J=1.850)，6.46(1H，dd，J=8.422，J=2.225)，7.34(1H，dd，J=8.422，J=1.850)，5.00(1H，s)，9.15(1H，s)。上述產物經核磁共振氫譜測定，在化學位移δ=6.27處存在苯環上芳香胺的共振吸收峰，說明半抗原合成成功。多菌靈半抗原合成路線見圖1。

1.2.2 免疫原制備 稱取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中，得到溶液A；用0.2 mL H2O 溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺各30 mg，加入至溶液A中，攪拌30 min；取15 mg半抗原，溶解于1 mL 二甲基甲酰胺溶液中，然后緩慢加入到溶液A中溶解，攪拌24 h。透析后分裝，-20 ℃保存。

1.2.3 包被原制備 稱取卵清蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中，得到溶液B；用0.2 mL H2O 溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺各30 mg，加入至溶液B中，攪拌30 min；取13 mg半抗原，溶解于1 mL 二甲基甲酰胺中，然后緩慢加入到溶液B中溶解，攪拌24 h。透析后分裝，-20 ℃保存。

圖1 多菌靈半抗原合成Figure 1 Synthesis of carbendazim hapten

1.3 酶標記抗抗體制備

利用1.2得到的免疫原免疫Balb/c，制備雜交瘤細胞株，純化出多菌靈單克隆抗體[16]，免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體[17]，再用辣根過氧化物酶進行標記[18]，得到酶標記抗抗體。

1.4 抗原包被濃度、單克隆抗體濃度選擇及酶標板制備

(1) 對制備的抗原依次進行1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000的梯度稀釋，對制備的單克隆抗體依次進行1∶10 000，1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000的梯度稀釋，測定波長為450 nm，按式(1)計算百分吸光率。

(1)

式中：

K——百分吸光率，%；

B——標準品或樣本溶液的平均吸光度值；

B0——0 μg/L標準溶液的平均吸光度值。

(2) 包被酶標板的抗原包被液體積為100 μL，需在37 ℃下孵育2 h，再加入150 μL 0.02 mol/L PBS緩沖液，其中牛血清白蛋白的質量分數為0.05%，37 ℃下孵育2 h[19]，即完成酶標板制備。

1.5 煙葉中多菌靈殘留量測定

利用RIDAWIN數據分析軟件建立標準曲線，分別以待測藥物的標準品濃度、Logit(B/B0)為標準曲線的橫、縱坐標，將待測樣本的吸光度值代入該曲線，即可測定出多菌靈殘留量。

1.6 關鍵指標檢測

1.6.1 檢測限 取20份經過確證的空白樣本，利用1.5的方法檢測樣本濃度，并計算20份樣本濃度的標準差，所測樣本濃度的平均值與其3倍標準差之和即為檢測限[20]。

1.6.2 精密度和準確度 將多菌靈標準品添加至煙葉樣本，添加濃度分別為300，600，1 200 μg/kg，檢測3個濃度的煙葉樣本回收率。煙葉樣本做4個平行，計算相對標準偏差(RSD)。

1.6.3 穩定性 將試驗制備的試劑盒于4 ℃下存放，每月固定日期測定最大吸光度值(0 μg/L)、試劑盒IC50以及煙葉樣本的回收率，連續測定12個月。

1.6.4 抗體特異性 噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑與多菌靈的結構類似，測定上述藥物的IC50，根據式(2)計算噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應率。引起50%抑制的多菌靈濃度與引起50%抑制的多菌靈類似物濃度的百分比，即為交叉反應率。

(2)

式中：

R——交叉反應率，%；

C1——引起50%抑制的多菌靈濃度，μg/L；

C2——引起50%抑制的多菌靈類似物濃度，μg/L。

2 結果與分析

2.1 抗原包被濃度、單克隆抗體濃度選擇

測定濃度為0.0，0.1 μg/L的多菌靈標準品的吸光度值(見表1)，根據式(1)計算B(0.1 μg/L)/B0(0.0 μg/L)的百分吸光率。理論上在抗原數量一定的情況下，抗體只有達到一定數量才能有效結合，然而實際應用中，抗原和單克隆抗體作為制備酶聯免疫試劑盒的最關鍵原料，理想情況是在能夠保證有效反應的情況下，抗體量最小；稀釋倍數越大，同樣產量的原料能夠制備的試劑盒就越多。根據已有的研究[21]，如果能夠達到B(0.1 μg/L)/B0(0.0 μg/L)的百分吸光率在70%～85%的要求，那么稀釋倍數越大，原料就能節省得越多。因此，選擇抗原稀釋倍數為8 000，單克隆抗體稀釋倍數為80 000。

2.2 標準曲線

利用RIDAWIN數據分析軟件建立標準曲線(見圖2)，標準曲線的范圍為0.0～8.1 μg/L，試劑盒的半數抑制濃度(IC50)為0.851 μg/L；得到的線性方程為：y=-1.686x+1.117，決定系數R2為0.995。

2.3 檢測限

由表2可知，該方法對煙葉、蘋果、白菜及茶葉樣本的檢測限分別為266.3，421.0，349.1，484.4 μg/kg。優于吳燕等[12]針對茶葉建立的基于表面增強拉曼光譜測定方法(定量限為2 000 μg/L)。GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定了多菌靈對蘋果、白菜、茶葉的最大殘留限量均為5 mg/kg(暫未對煙葉進行規定)。因此，該方法能夠滿足對多菌靈的檢測要求。

表1 抗原、抗體的濃度選擇(OD450 nm)Table 1 Optimal concentration of antigen and antibody (OD450 nm)

圖2 多菌靈標準曲線Figure 2 Standard curve of carbendazim

2.4 精密度和準確度

由表3可知，不同添加水平多菌靈的煙葉樣本的回收率為76.0%～102.2%，批內相對標準偏差為4.8%～9.7%，批間相對標準偏差為8.0%～8.6%。酶聯免疫試劑盒的準確性與精密度有關，批內與批間的相對標準偏差均在10%以內，能保證測試的準確性。

表2 樣本的檢測限測定Table 2 Determination of detection limit of samples (n=20) μg/kg

2.5 穩定性

由表4可知，試劑盒于4 ℃保存能夠正常檢測12個月，試驗期間其最大吸光度值(0 μg/L)范圍為1.59～1.91，IC50范圍為0.367～0.772 μg/L，煙葉樣本的回收率范圍為72.6%～95.3%，均未顯示異常。說明該酶聯免疫試劑盒的穩定性良好，在4 ℃下能夠保存12個月。

表3 精密度及準確度試驗Table 3 Precision and accuracy test

表4 穩定性試驗Table 4 Stability of the kit at 4 ℃

2.6 抗體特異性

噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑為應用廣泛的殺菌劑。通過測定多菌靈抗體與噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應率，發現多菌靈抗體與噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應率<1%，說明多菌靈抗體的特異性良好。

3 結論

試驗建立了一種煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留的酶聯免疫吸附方法，通過制備出特異性良好的多菌靈單克隆抗體，將其應用于酶聯免疫試劑盒的制備。結果表明，該方法穩定性好，檢測時間僅為45～60 min，并且不需要昂貴的儀器，適用于基層實驗室對煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留量進行批量檢測。GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定了多菌靈對6種谷物、4種油料油脂、16種蔬菜、28種水果等食品類別的最大殘留限量，而試驗研究樣本僅限于蘋果、白菜等果蔬，今后可根據市場需求，結合該標準對樣本進行拓展。