凍融循環過程中鮰魚片K值的近紅外預測模型研究

錢曉慶 朱 萌 石鋼鵬 熊光權 石 柳 吳文錦 汪 蘭 汪訓枝 丁安子

(1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430064；3.湖北省農業科技創新中心，湖北 武漢 430064；4.陽新縣農業農村局，湖北 黃石 435200)

鮰魚(Channelcatfish)學名長吻鮠，是中國名貴的淡水魚類，2018年產量為23.04萬t。鮰魚肉質嫩滑不肥膩、味美不腥，且無肌間刺，深受消費者青睞。為保證較好的食用品質，常采用冷藏、冰藏、微凍貯藏等方式對鮰魚進行低溫貯運。貯運銷售過程中，常通過監測鮰魚原料的新鮮度以確保其食用品質處于較佳狀態。

鮰魚等水產品新鮮度評價指標包括細菌總數[1]、揮發性鹽基氮(TVB-N)[2]、2-硫代巴比妥酸值(TBARS)[3]和K值[4]，其中K值反映水產品中核苷酸分解產物含量變化[5]，最能體現水產品新鮮度變化[6]。付奧等[7]研究了冷藏條件下草魚三磷酸腺苷(ATP)關聯產物的含量及K值的變化；戚曉玉等[8]研究了冰藏條件下日本沼蝦ATP降解產物的含量變化及其對鮮度的影響；張龍騰等[9]研究了微凍貯藏條件下鰱魚片品質指標、ATP關聯產物及ATP關聯酶活性的變化規律。實際貯運中，鮰魚從產地→冷鏈物流→賣場→消費者，伴隨著長距離的運輸、環境溫度的變化等多種不確定因素，其貯運過程類似于凍融循環過程。目前有關凍融循環貯藏相關研究較少，且側重于對水產品肌肉品質的影響研究[10-11]，對水產品新鮮度影響及預測研究尚未見報道。

近紅外光譜法是一種新興的光譜分析方法，利用有機物中含氫基團(C—H、O—H、N—H等)的倍頻與合頻吸收，對特定化合物(如蛋白質、水分等)實現快速、無損的定性/定量分析[12-15]。因此，近紅外光譜法在水產品新鮮度分析領域也得到廣泛研究，其對鯽魚[16]、鯉魚[17]、金槍魚[18]、鱈魚[19]和大馬哈魚[20]的新鮮度均具有較好的預測能力。而利用近紅外光譜技術分析檢測鮰魚新鮮度的研究尚未見報道。試驗擬以鮰魚為研究對象，采用高效液相色譜法(HPLC)分析凍融循環貯藏條件下ATP關聯產物含量的變化及其對新鮮度K值的影響，并利用偏最小二乘法建立新鮮度K值的近紅外定量預測模型，以期為水產品在運輸、貯藏和銷售過程中保持較佳新鮮度提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斑點叉尾鮰：魚體規格為(2.00±0.30) kg，共24條(依次編號為A～X)，帶水運輸至實驗室進行后續處理，市售；

氫氧化鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)、次黃嘌呤(Hx)：色譜級，美國Sigma-Aldrich公司；

聚乙烯袋：上海廣佳信息技術有限公司；

旋渦混合器：WH966型，上海康華生化儀器制造有限公司；

pH計：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速冷凍離心機：GL-25Ms型，上海盧湘儀實驗室儀器有限公司；

超純水機：YLY-100BU型，深圳市億利源水處理設備有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

傅里葉變換近紅外光譜儀：AntarisⅡ型，美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 鮰魚覆冰致暈后宰殺，去頭去尾后對半剖切，去除魚皮及紅肉，按圖1所示取背部肌肉約30 g，并切割為5份，每塊魚肉分別編號為1A、1B、…、5X，共計120份魚肉。用純水洗凈魚肉表面血跡，瀝干后放入聚乙烯袋中，-18 ℃下冷凍48 h，然后轉入4 ℃下解凍24 h，視為一次凍融循環處理，分別凍融循環處理1～5次。凍融循環處理后的120份鮰魚片樣品根據隨機抽取的原則，將其中100份作為校正集，其余20份作為驗證集。每份鮰魚片樣品先進行近紅外光譜采集，隨后迅速剁碎制備新鮮度樣品。

1.2.2 近紅外光譜采集 將凍融循環處理后的120份鮰魚片放入樣品盒內，用傅里葉變換近紅外光譜儀進行光譜測定，每個樣品測量3次取平均值。

1.2.3 新鮮度測定

(1) 樣品處理：將采集完光譜學數據的鮰魚片在預冷過的砧板上剁碎混勻。準確稱取2.000 g魚肉樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL預冷過的10%高氯酸溶液旋渦振蕩1 min，低溫離心10 min(4 ℃，8 000 r/min)后保留上清液。沉淀物加入10 mL預冷過的5%高氯酸溶液旋渦振蕩1 min，低溫離心10 min(4 ℃，8 000 r/min)保留上清液，重復上述操作1次，合并上清液。用1 mol/LNaOH溶液調節pH至6.0～6.4，再用預冷過的超純水定容至50 mL。定容后的樣液用0.22 μm水相微孔濾膜過濾，濾液移入1.5 mL樣品瓶中，保存于-18 ℃待測。

圖1 鮰魚片取樣示意圖Figure 1 Catfish sampling

(2) 標準曲線繪制：準確稱取ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx等標準品，用超純水配制成濃度為1.00 mg/mL 的標準儲備液，其中Hx標準儲備液的濃度為0.50 mg/mL。用流動相配制混合標準溶液，使ATP、ADP、AMP、IMP、HxR的濃度梯度為0.2，0.5，1.0，5.0，15.0，40.0，100.0 μg/mL，Hx的濃度梯度為0.10，0.25，0.50，2.50，7.50，20.00，50.00 μg/mL，繪制標準曲線，其曲線方程見表1。

表1 ATP關聯產物的標準曲線Table 1 Thestanard curves of ATP-related compound composition

(3) 色譜條件：色譜柱為月旭Ultimate AQ-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相為0.02 mol/L KH2PO4溶液和0.02 mol/L K2HPO4溶液等體積混合后用85%磷酸調節pH至6.0；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量20 μL。

(4) ATP關聯化合物含量計算：繪制ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx標準曲線，參照Yokoyama等[21]的方法，按式(1)計算ATP關聯化合物含量。

(1)

式中：

X——樣品中ATP關聯化合物含量，μmol/g；

C——標準工作液中ATP關聯化合物質量濃度，μg/mL；

V——樣品提取液定容后體積，mL；

m——稱取樣品質量，g；

M——6種ATP關聯化合物的分子質量。

(5) K值計算：參照SC/T 3048—2014，按式(2)計算K值[22]。

(2)

式中：

K——新鮮度K值，%；

nATP——三磷酸腺苷的質量摩爾濃度，μmol/g；

nADP——二磷酸腺苷的質量摩爾濃度，μmol/g；

nAMP——腺苷酸的質量摩爾濃度，μmol/g；

nIMP——肌苷酸的質量摩爾濃度，μmol/g；

nHxR——次黃嘌呤核苷的質量摩爾濃度，μmol/g；

nHx——次黃嘌呤的質量摩爾濃度，μmol/g。

一般認為K值在20%以下為優良鮮度指標，20%～50%為中等鮮度指標，超過60%為不可接受[23]。

1.2.4 數據處理 采用Excel 2013軟件進行數據處理，采用SPSS 16.0軟件進行顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。參照管驍等[24]的方法，采用Unscrambler 9.7軟件對120份鮰魚片近紅外光譜數據進行預處理，并采用偏最小二乘法(PLS)建立模型，通過校正決定系數(R2)、校正均方根誤差(RMSEC)、交叉驗證決定系數(R2)和預測均方根誤差(RMSEP)對模型預測能力進行評價，優化預測模型。

2 結果與分析

2.1 凍融循環過程中ATP關聯產物含量的變化

由圖2(a)可知，隨著凍融循環次數的增加，ATP含量先顯著下降(P<0.05)后穩定維持在較低濃度，這是由于ATP酶活隨貯藏時間的延長而迅速降低，與吳依蒙等[25]的結果一致。凍融循環5次后，ATP含量由初始的2.15 μmol/g降至0.02 μmol/g。在ATP酶的作用下，ATP迅速分解為ADP和AMP。前2次凍融循環過程中，魚肉內ATP酶活性較高，ATP含量顯著下降。Watabe等[26]研究發現，低溫條件下魚肉肌漿內質網(Sarcoplasmicreticulum)吸收鈣離子的能力下降，肌原纖維中鈣離子濃度增加，從而激活Mg2+-ATP酶使ATP降解。

由圖2(b)可知，IMP含量隨凍融循環次數的增加先升高后降低。第1次凍融循環，IMP含量由初始的4.07 μmol/g 顯著上升(P<0.05)至5.98 μmol/g；第2～5次凍融循環，IMP含量顯著降低(P<0.05)，由4.51 μmol/g 降至0.04 μmol/g。IMP是由AMP在其脫氨酶的作用下分解產生，隨后被核苷酸酶降解。凍融循環初期，ATP、ADP、AMP各自對應的降解酶活性非常高，各種前體物質被迅速降解為IMP，造成IMP含量的迅速升高。第2次凍融循環，IMP含量依然維持在一個較高的水平，處于蓄積狀態，與楊文鴿等[27]的結果一致；第3～5次凍融循環，IMP含量顯著降低。Songsaeng等[28]研究發現，貯藏中嗜冷菌的生長繁殖會造成IMP含量降低，如革蘭氏陽性菌(Gram-positivebacteria)和芽孢桿菌(Spore-formingbacteria)。5次凍融循環貯藏，鮰魚在4 ℃ 下共貯藏5 d，IMP含量僅為最高值的0.67%，降解速率遠大于冰藏、冷藏和微凍條件。如大黃魚冰藏5 d后的IMP含量約為最高值的60%[27]；中華絨螯蟹冷藏5 d 后的IMP含量約為最高值的50%[29]；鰱魚微凍貯藏5 d后的IMP含量約為最高值的70%[9]。

小寫字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)圖2 凍融循環過程中鮰魚肉片ATP關聯產物含量的變化Figure 2 Changes of ATP-related compound composition in catfish fillets during the freeze-thaw cycles

由圖2(c)可知，Hx含量隨凍融循環次數的增加而顯著升高(P<0.05)，第5次凍融循環時，Hx含量由初始的0.08 μmol/g上升至19.65 μmol/g。Hx是由HxR在核糖水解酶的作用下脫去核糖生成，是導致魚肉產生苦澀味的主要物質[30]。根據魚肉中HxR與Hx含量變化的不同，可分為3種類型：HxR含量隨時間顯著增加為HxR型，如鰹魚(Katsuwonuspelamis)[26]；Hx含量顯著增加為Hx型，如棕點石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)[31]；HxR、Hx含量均增加為中間型，如日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[8]。故試驗鮰魚片中Hx含量屬于Hx型。

2.2 凍融循環過程中K值的變化

由圖3可知，隨著凍融循環次數的增加，K值呈顯著上升趨勢(P<0.05)。宰殺時，鮰魚片K值為5.33%；第1次凍融循環，K值為15.33%，鮰魚片處于優良鮮度范圍內；第2次凍融循環，K值達到28.94%，鮰魚片處于中等鮮度范圍內；第3次凍融循環，K值變化極顯著(P<0.01)，達到67.95%，鮰魚片已進入腐敗階段；第5次凍融循環，K值為93.96%，鮰魚片已完全腐敗。

小寫字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)圖3 凍融循環過程中鮰魚片K值的變化Figure 3 Change of K value in catfish fillets during the freeze-thaw cycle

凍融循環過程中，各種內源性酶的作用及嗜冷微生物的生長繁殖造成ATP關聯化合物含量的變化，進而造成K值的變化。其中，IMP含量的下降和Hx含量的上升是K值變化的主要因素。第3次凍融循環，由于IMP顯著下降，Hx顯著上升，最終造成K值極顯著升高(P<0.01)。姜楊等[1]研究表明，草魚冷藏15 d，新鮮度K值達80%，與鮰魚凍融循環4次的相當；蔣晨毓等[31]研究表明，鳙魚冷藏16 d，新鮮度K值達90%，與鮰魚凍融循環5次的相當。

2.3 新鮮度近紅外模型的建立及驗證

2.3.1 新鮮度近紅外模型的建立 120份凍融循環鮰魚片樣品的新鮮度K值最小為4.88%，最大為95.10%，校正集和驗證集的K值數據范圍均符合建立近紅外定量建模的需求。

由圖4可知，不同樣本的譜圖形狀極其相似，1 000～2 500 nm內均有明顯吸收峰，其中2 000～2 500 nm范圍內較為分散，1 000～1 400 nm范圍內較為接近。1 150～1 200，1 400～1 450，1 900～1 950 nm處吸收峰為O—H鍵的倍頻及合頻吸收，受樣品中水分的影響，因魚肉中水分含量遠超蛋白質及脂肪等，因此O—H鍵的吸收峰非常明顯；1 500～1 550 nm處為N—H鍵伸縮振動產生的合頻吸收，受樣品中蛋白質或氨基酸相關組分的影響；1 170～1 250 nm處為C—H鍵的倍頻吸收，受樣品中脂肪的影響。魚肉新鮮度的變化往往伴隨著水分、蛋白質和脂肪含量的變化，其光譜變化為這些官能團吸收峰的綜合表現。

圖4 120份鮰魚片樣品近紅外光譜圖Figure 4 NIR spectra of 120 catfish samples

由表2可知，濾波擬合法(SG)聯合標準正態變換(SNV)處理的模型的校正和預測決定系數最高，校正和預測均方根誤差最低，模型預測效果最佳。

由圖5可知，模型預測決定系數R2為0.938 1，預測均方根誤差RMSEP為1.49，說明預測值和實測值差距較小，模型效果較好。

表2 建模條件優化Table 2 Optimization of conditions for establishing calibration model

圖5 鮰魚片新鮮度校正模型和交叉驗證模型的實測值和預測值相關圖Figure 5 Correlation graph of measured and predicted values of the corrected model and cross-validation model for catfish fillets freshness

利用近紅外定量模型對樣品集的近紅外光譜數據進行預測，計算該樣品的新鮮度K值，并與該樣品的實測值進行比較，驗證該模型的準確性。20份驗證集樣品的t=0.964 272

2.3.2 新鮮度近紅外模型的驗證 為驗證PLS模型的預測精確度，將未參與建模的20份驗證樣品組成的驗證集代入模型進行驗證，并將模型預測值與實測值進行比較分析，其結果見表3，樣本方差分析見表4。

由表4可知，F

表3 鮰魚片新鮮度模型預測值與實測值比較Table 3 Comparison of predicted value and measured value of freshness of catfish fillets %

表4 雙樣本方差分析Table 4 Two-sample analysis of variance

3 結論

測定了凍融循環過程中鮰魚片的新鮮度并建立了近紅外預測模型。結果表明，隨著凍融循環次數的增加，鮰魚片樣本的三磷酸腺苷含量先急劇下降后維持在較低水平；肌苷酸含量先上升后下降，有一個蓄積過程；次黃嘌呤含量顯著上升；K值顯著上升(P<0.05)，凍融循環3次后，K值>60%，鮰魚片開始腐敗。近紅外光譜數據經濾波擬合法及標準正態變換預處理后，采用偏最小二乘法建立的預測模型的預測值決定系數最高(R2=0.938 1)，預測均方根誤差最低(RMSEP=1.49)，效果最佳。驗證集樣品的t

研究尚未探討凍融循環處理鮰魚片新鮮度變化的原因，后續可圍繞凍融循環處理對魚肉組織中三磷酸腺苷降解關鍵酶的釋放及活性變化等方面進行研究，闡明鮰魚片在凍融循環處理過程中的新鮮度變化機理。此外，研究所建立的模型只能根據測定的近紅外光譜數據快速預測鮰魚片當前新鮮度(K值)，后續可結合貯運過程中溫度數據預測鮰魚片新鮮度變化趨勢，實現對低溫貯運條件的優化與控制。