基于SSR標記的大麥種質資源遺傳多樣性分析

秦丹丹，杜 靜，許甫超，徐 晴，葛雙桃，彭嚴春，董 靜*

（1.湖北省農業科學院糧食作物研究所/糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北武漢430064；2.長江大學，湖北荊州434200）

大麥是世界也是我國第四大谷類作物，具有食用、飼用、釀造、保健等多重用途。但是，長期以來，我國的大麥生產自給率較低、對外依存度高。根據海關數據，2019年1—11月，我國從加拿大、澳大利亞等大麥主要出口國進口大麥596萬t。自2020年5月19日起，我國對原產于澳大利亞的進口大麥征收反傾銷稅。這項舉措既為大麥育種工作者提供了機遇，同時也提出了挑戰。現階段，為快速有效地將我國大麥從長期依賴進口的困境中解脫出來，保障國家糧食安全和社會穩定，優異專用型大麥新品種的培育工作仍然是育種工作者工作中的重中之重。

在大麥新品種選育過程中，對種質資源進行鑒定和評價是首要任務。在分子水平上對其進行遺傳多樣性分析，了解其親緣關系遠近，有助于我們更有針對性地、更準確地選擇雜交親本，在后代中獲得優良變異，從而為大麥雜種優勢利用及新品種選育提供可利用的信息[1]。隨著Saghai-Maroof等首次利用4個簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記對207份大麥種質的遺傳多樣性進行研究[2]后，AFLP[3]、RAPD[4]、SSR[2]以及新近發展的SNP[5]等各種類型的分子標記在大麥遺傳多樣性研究中都得到了應用。其中，SSR標記為共顯性標記，因其多態性高、數目多、操作簡單、易于鑒別、價格便宜等優點而在大麥的遺傳多樣性研究中被國內外學者廣泛應用[6-9]。

本研究在對416對SSR引物進行篩選的基礎上，利用其中多態性穩定可靠、條帶清晰的53對SSR分子標記對157份國內外大麥種質資源（多為長江中下游麥區選育品種，包含筆者所在單位自育品種）進行了遺傳多樣性分析，旨在從分子水平上揭示筆者所在單位所收集保存的大麥種質間的親緣關系，為后期雜種優勢利用及突破型大麥新品種選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究參試材料為157份來源于國內外的大麥種質資源，以長江中下游麥區自育品種為主，其中來自湖北省（鄂系列、華系列、楚系列、荊系列等）、江蘇省（蘇系列和揚系列）、浙江省（浙系列）和河南省（駐系列）的材料分別有34、14、6和9份，均由湖北省農業科學院糧食作物研究所麥類育種課題組收集、創制和保存，材料名稱詳見表1。

1.2 SSR分子標記的擴增方法

田間取各材料新鮮健壯的葉片，采用CTAB法提取DNA，SSR引物來源于Graingene（http://wheat.pw.usda.gov/GG3），由上海英駿公司合成。10μL的PCR擴增反應體系中包含模板DNA（50 ng/μL）1.0～1.5μL，正向引物（10μmol/L）和反向引物（10μmol/L）各1μL，2×Takara Master Mix 5μL，ddH2O 1.5～2.0μL。PCR擴增程序為：94℃5 min；35個循環的程序為94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s；最后72℃延伸5 min。PCR產物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并通過硝酸銀染色法顯色。

1.3 帶型統計和分析

將SSR分析中的任一擴增帶看作一個等位位點，根據多態性引物擴增條帶的有無，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，建立1，0型二元數據矩陣。采用Nei-li指數法，計算樣本間遺傳相似系數（GS）[12]。GS=2Nij/（Ni+Nj），式中：Nij是指材料i和j共有的片段數目；Ni和Nj分別為材料i和材料j中出現的片段數目。用NTsys 2.10e軟件，根據非加權平均值的方法，繪制基于遺傳距離的算術平均值的非加權對群方法（Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages，UPGMA）聚類圖，用于群體間遺傳關系分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

本研究首先利用來源差異較大的24份大麥種質對416對SSR引物進行篩選。根據分型結果，共篩選出117對擴增條帶清晰、穩定性好且差異明顯的多態性引物。在157份大麥種質中對這117對引物進行分析，結果發現，其中54對引物在較大群體中仍然表現為多態性穩定，大麥的1H～7H染色體上分別有7、7、6、8、8、8和10條（表2），將這部分結果用于后續遺傳多樣性分析。

表2 54對SSR引物序列、位置及擴增產物數目

續表

2.2 引物在供試材料中的多態性位點信息

進一步對54對多態性引物在大麥種質資源中的擴增和分型結果進行分析發現，每對引物的擴增產物為1～7條帶，如Bmag0206擴增產物只有1條帶，Ebmac0701擴增產物有6條帶，而Bmag0496擴增產物多達7條（表2）。54對引物共擴增出188條清晰可辨的條帶，其中172條具有多態性（表2），多態性比率為91.5%。

2.3 供試材料的聚類分析

根據SSR分析所得的1,0型數據聚類并作圖（圖1），由聚類圖可見，相似系數分布范圍為0.542 8～0.930 4。其中，G033T034U和永4783遺傳相似系數最高，為0.930 4，表明兩者親緣關系最近。城間大麥和通99-36遺傳相似系數最低，為0.542 8，兩者親緣關系最遠。為了更好地表示157個品種之間的親緣關系，在遺傳相似系數GS≥0.665 7，將供試的157份大麥種質分成了5大類。

第一大類共包括6份材料，有Morex、GAMMA、城間大麥、PALLLDUM、ODESSKIY和鄂大麥9706。

第二大類共包括29份材料，有鄂大麥10號、創大麥43、廣豐3號、揚農啤5號、駐5-189、揚農啤1號、揚農啤6號、03IN9-42、Harrington、甘墾5號、G033T034U、永4783、G033T059U、G033T025U、駐96005矮裸、日喀則-2、03IN5-212、揚農啤8號、Ecjotic、03IN5-156、03IN5-180、日喀則-1、日喀則S-1、ZDM9950、日喀則S-2、03IN5-20、蘇啤4號、品5804和Manker。

第三大類共包括15份材料，有華大麥4號、華2236、華2539、永4564、荊02-248、駐97017-2-1、東84342-1、DMAS004、浙皮1號單、揚農啤8號*、揚農啤8號**、Z134V065W、甘肅2012引、Z212V009W和cherron。

第四大類共包括45份材料，由2個亞類組成。第一亞類有Djerlo、03IN5-232、BADORIY、駐大麥7號 和03IN5-298。第 二 亞 類 包 括 華2151、Z212V025W、S-192、華2328、鳳 大 麥7號、Z188V023W、鄂大麥9號、浙5819、太福1號、甘墾6號、華2162、莆系14、閩保、03京2025-2026、莆大麥7號、華2114、XYL-601、鄂大麥7號、G231M004M、揚農啤9號、Kharkovski、矮單2-8、矮壯21、申河085、駐大麥5號、浙3521、蘇啤3號、駐大麥5號*、關東黃金、蘇啤6號、駐大麥998、浙3521*、云大麥2號、WDM7127、駐大麥6號、墨P、甘啤5號、WDM7140、通99-36和G049T060U。

第五大類共包含62份材料，也由2個亞類組成。第一亞類包括華2005、鄂大麥8號、鄂大麥68231、鄂大麥766、鑒75、陜引1號、C54S-1皮、閩誘3號、JB05-06、C54S-1藍、85G46、鄂大麥883、楚0709、鄂大麥065、YN21、Goldenpromise、閩麥2號、花11、二芒大麥、釀造二條*、浙08-92、花30、揚農啤7號、青海-4、青海-6、杭農-81、Athes、entry26、單二、揚輻6008、鄂大麥886、云南-1、釀造二條、鄂大麥507、蒲09019、鄂大麥610、鄂6741、鄂大麥588、AcStephen、BBD-40、鳳18-11和鄂啤2號，共42份材料。第二亞類包括華2759、鄂大麥6號、揚農啤2號、楚大麥38、品比5755、荊02-461、華2255、駐3-257、保大麥12號、烏金3號、浙07-6、揚農啤4號、云飼麥1號、華大麥12、I-2、楚09-05、華10118、華2908、03IN5-152和03IN5-154，共20份材料。

3 結論與討論

種質資源的篩選、鑒定和評價是進行作物遺傳改良的基礎，而分析現有種質資源的遺傳多樣性，尤其是在分子水平上，有助于我們更精準地了解材料間的親緣關系，從而有選擇性地開展親本組配工作。本研究在對400余對SSR引物進行初步篩選的基礎上，挑選出54對多態性穩定且清晰可辨的引物，這些引物均勻分布在大麥1H～7H染色體上，基本覆蓋大麥的整個基因組，具有一定的代表性。隨后利用這54對SSR標記對157份國內外大麥種質資源進行了遺傳多樣性分析，以期為本單位的大麥新品種選育工作提供依據。雖然AFLP[3]、RAPD[4]、SSR[2]以及新近發展的SNP[5]等各種類型的分子標記在大麥遺傳多樣性研究中都得到了應用，但是SSR仍是目前進行大麥遺傳多樣性初步分析中首選的標記類型，并被廣泛應用于大麥DUS測定[13]、農藝性狀[14]、抗旱性[15]、耐鹽性[16]以及抗病性[17]等性狀的關聯分析等研究。

雖然國內外學者利用SSR標記開展了多項關于大麥不同種質遺傳多樣性的研究，但是各研究所選的SSR標記卻大不相同，很少有共同的標記。本研究篩選出的54對引物中，與部分其他研究相比，如92個用于分析108份青稞親本材料的SSR標記[14]、27對用于分析我國西藏與中東地區近緣野生大麥遺傳多樣性的SSR標記[18]、用于分析61個國家2 625份大麥種質遺傳多樣性的35對SSR引物[19]和42對用于分析以色列不同地區的144份野生大麥遺傳多樣性的SSR標記[20]，都分別只有5～6個共同標記。這些研究相互之間的共同標記數目也很少，一方面可能是由于各單位所保存的SSR標記中相互間共同的本身就比較少，另一方面也可能是由于所選用的材料來源范圍不同。目前，為了避免不必要的重復，更高效地評價大麥種質的遺傳多樣性，筆者認為，在未來的工作中，還急需篩選一套通用的、科學的、具有代表性并可用于評價種質真實性或者多樣性的SSR引物。

本研究發現本課題組所保存的擁有相同名稱的材料，在聚類分析中可能處于不同類，如揚農啤8號、揚農啤8號*和揚農啤8號**分別屬于第二大類和第三大類（圖1）。這些材料系不同年份從不同地點或單位引進的，它們在分子水平上的差異一方面可能是由于各單位相互引種時存在偏差，另一方面也可能是材料在保存或繁殖過程中出現了混雜。

與多數聚類分析結果[21-22]類似，本研究也發現聚類結果與材料的來源相對一致，如來自湖北省農業科學院的鄂大麥品種（系）除鄂大麥10號、鄂大麥7號、鄂大麥9號、鄂大麥6號外，都聚在第五大類第二亞類。第五大類還包含了另外的湖北省自育品種，如荊系列和華系列。而來自西藏日喀則地區的大麥品種聚在第二大類，來自河南省的駐大麥品種（系）大多聚在第四大類，少數的國外品種夾雜在各個類群中。說明國內的大麥育種普遍存在遺傳基礎相對單一的問題，這種現象不利于災害嚴重年份中大麥穩產，在生產上具有一定的風險。這就要求在育種中加強外來種質資源的利用，擴寬遺傳基礎。事實上，近年來，國內的各大麥育種單位包括筆者所在團隊也多次從加拿大、澳大利亞等大麥主要出口國引進部分優異種質資源。但是，從筆者所在團隊的育種實踐來看，受國內外生態環境不同的影響，這些種質在當地的表現可能與品種本來的表現不同。例如，從加拿大引進的種質就存在普遍偏高的缺點，導致這些種質很難在育種中直接利用。針對這些種質，我們一方面應該進行多年的綜合農藝性狀評價，另一方面，也需要對其進行分子層面上的解析，通過分子標記輔助育種或者基因編輯等策略有目的地進行利用。