玉米ZmRab6A基因的克隆與生物信息學分析

時丕彪，胡鳳琴，顧小兵，呂遠大

（1.鹽城市新洋農業試驗站，江蘇鹽城224049；2.中國科學院南京土壤研究所，江蘇南京210008 3.江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所，江蘇南京210014；）

Rab蛋白是一類小分子量三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate,GTP）結合蛋白，主要參與細胞器間的膜轉運，將貨物蛋白通過囊泡運輸到目的地[1]。GTP結合蛋白在GTP與之結合時被激活，在GTP水解為GDP過程中失活，因此這類蛋白在這些過程中起著分子開關的作用[2-3]。Rab基因家族是植物重要的一類超大基因家族。研究表明，Rab家族不僅與植物的生長發育密切相關，而且在逆境脅迫和抗病方面也發揮著重要的作用[4]。目前，在擬南芥中已發現57個Rab蛋白，并將其分為8個亞家族：RabA～H[5]。T-DNA插入突變體試驗表明，AtRabD2b和AtRabD2c在擬南芥花粉發育和花粉管生長方面起著重要的作用，并且它們在功能上是冗余的[6]。煙草中過量表達NtRab2基因會抑制花粉管的生長[7]。而將御谷PgRab7基因轉入煙草中能顯著增強煙草對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受性，說明PgRab7基因可能參與了植物脅迫響應[8]。在轉基因水稻中過表達OsRab11基因，發現通過影響茉莉酸代謝途徑相關基因的表達，增強了植株對病原菌的抗性[9]。TaRab7基因在小麥與條銹菌互作早期和抗逆性中起著重要的作用[10]。PtRabE1b的過量表達增強了楊樹的耐鹽性[11]。

玉米為世界上重要的糧食作物之一，關于Rab基因在玉米中的研究較少。因此，本研究克隆了玉米ZmRab6A基因并對其序列進行測定，分析了其編碼蛋白的理化性質、保守結構域、二級結構、三級結構及與其他物種的親緣關系等特征，為下一步研究其分子生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

玉米材料為筆者所在課題組保存的玉米自交系B73。取健壯幼苗的葉片組織，液氮速凍后保存在-80℃冰箱用于RNA提取。

1.2 玉米總RNA提取及cDNA合成

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說明書提取玉米葉片總RNA。按照美國Thermo Scientific公司的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第1條鏈，作為PCR擴增的模板。

1.3 玉米ZmRab6A基因的克隆

根據GeneBank登錄的ZmRab6A基因序列，設計1對基因特異性引物，正向引物F：5'-CCCTGGT CTGTGGCCTCTGCGCTCC-3'，反向引物R：5'-TTATTTCGAAACAAAAGACCCGGTGT GATTC-3'，進行PCR擴增。擴增體系總體積50μL，其中2×Taq Master Mix 25μL，cDNA模板1μL，正反向引物各1μL，ddH2O 22μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸5 min。PCR產物膠回收后連接到pMD18-T載體，然后轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。菌液PCR驗證為陽性單菌落的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4 ZmRab6A基因的生物信息學分析

利用ORF finder在線分析ZmRab6A基因的開放閱讀框架并翻譯成氨基酸，利用Ex PASy Prot Param預測ZmRab6A編碼蛋白的相對分子量和理論等電點，分別使用在線軟件GORⅣ和SWISS-MODEL預測蛋白的二級結構和三級結構，用國家生物技術信息中心的保守結構域數據庫NCBI CDD分析蛋白的保守結構域，Prot Scale在線預測蛋白的親疏水性，分別利用SignalP-5.0和TMHMM Server v.2.0分析信號肽和跨膜區域的有無，采用蛋白質亞細胞定位預測工具PSORT預測亞細胞定位。使用MEGA 5.05軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）（自展值bootstrap=1 000）構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 ZmRab6A基因的克隆

利用特異性引物進行RT-PCR擴增，從玉米葉片中克隆得到ZmRab6A基因1 044 bp的cDNA全長序列（圖1）。序列分析表明，該基因含有1個660 bp的開放閱讀框，編碼219個氨基酸；5'非翻譯區長155 bp，3'非翻譯區長229 bp（圖2）。在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6個外顯子和5個內含子，全長2 650 bp。

2.2 ZmRab6A的理化性質分析

利用ExPASy ProtParam分析ZmRab6A蛋白的理化性質，結果表明：其分子式為C1076H1726N288O338S9，相對分子量為24.39 ku，理論等電點為5.58；帶負電荷殘基（Asp+Glu）28個，帶正電荷殘基（Arg+Lys）26個；不穩定指數和脂肪族指數分別為46.68和86.76，推測ZmRab6A為不穩定蛋白。

2.3 ZmRab6A蛋白的親/疏水性分析

利用ProtScale預測ZmRab6A蛋白的親水性/疏水性，結果如圖3所示，該蛋白的N末端有一個很強的疏水性結構，第128位和129位異亮氨酸（Ile）疏水性最強，分值為2.344；C末端有一個很強的親水性結構，第209位絲氨酸（Ser）親水性最強，分值為-2.600。該蛋白的總平均親水性值為-0.173，推測其可能是親水蛋白。

2.4 ZmRab6A的跨膜區域和信號肽預測

利用TMHMMServer v.2.0預測ZmRab6A蛋白的跨膜區域，結果顯示，該蛋白沒有跨膜螺旋區，屬于非跨膜蛋白質（圖4）。使用SignalP-5.0預測ZmRab6A信號肽的可能性，其值為0.004，因此該蛋白沒有信號肽，屬于非分泌蛋白（圖5）。

2.5 ZmRab6A蛋白的保守結構域分析

結構域預測結果表明，ZmRab6A具有Rab蛋白典型的G結構域（G1、G2、G3、G4和G5），具有Rab6特異性位點，含有GTP/Mg2+結合位點，Rab蛋白特征序列RabF1、RabF2、RabF3、RabF4和RabF5，Rab亞家族序列RabSF1、RabSF2、RabSF3和RabSF4，開關Ⅰ、Ⅱ區域，同時還包含GEF互作位點、GDI互作位點和效應器互作位點，屬于P-loop_NTPase超家族。

2.6 ZmRab6A蛋白的亞細胞定位預測

PSORT預測結果表明，ZmRab6A主要定位于細胞質膜（45%），其次是葉綠體類囊體膜（28%）、葉綠體基質（20%）和葉綠體類囊體空間（20%）。因此，推測ZmRab6A可能是一種胞質蛋白。

2.7 ZmRab6A蛋白的二級結構和三級結構預測

二級結構預測結果表明，ZmRab6A蛋白主要由α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈構成，其中無規卷曲占比最大，為39.73%；其次是α-螺旋，占比37.90%；延伸鏈占22.37%（圖6-A）。三級結構預測結果表明，ZmRab6A蛋白的空間結構主要是無規卷曲和α-螺旋，含有少量延伸鏈，與二級結構預測結果一致（圖6-B）。

2.8 系統進化關系分析

基于NCBI的nr（non-redundant protein）蛋白數據庫，利用BLASTP程序，比對得到其他物種Rab蛋白的氨基酸序列。序列比對結果表明，ZmRab6A蛋白與高粱（Sorghum bicolor，XP_002461043.1）的一致性最高，達94%；其次是狗尾草（Setaria viridis，XP_034580146.1）和谷子（Setaria italica，XP_022679 790.1），均達92%；與菠蘿（Ananas comosus，XP_020 104318.1）、藜麥（Chenopodium quinoa，XP_02176572 6.1）、牽牛（Ipomoea nil，XP_019177322.1）、罌粟（Papaver somniferum，XP_026401556.1）、美花煙草（Nicotiana sylvestris，XP_009766624.1） 和 番 茄（Solanum lycopersicum，XP_004229706.1）的一致性分別為87%、86%、86%、85%、85%和85%；與亞麻芥（Camelina sativa，XP_010437115.1）、大 葉 藻（Zostera marina，KMZ76111.1）和 一 串 紅（Salvia splendens，TEY33177.1）的一致性分別為76%、76%和75%；與狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，XP_019416581.1）和 野 生 大 豆（Glycine soja，KHN31372.1）的一致性均為67%。以上均表現出較高的同源性。

系統進化樹分析結果顯示，玉米與同屬禾本科的高粱、狗尾草和谷子的Rab6A蛋白處于同一分支，親緣關系最近；與一串紅、亞麻芥和大葉藻的Rab6A親緣關系較遠，與豆科植物野生大豆和狹葉羽扇豆的親緣關系最遠（圖7）。

3 討論與結論

Rab GTP結合蛋白作為囊泡轉運的重要蛋白，參與了囊泡從供體細胞器出芽、與靶膜對接、拴系和融合的整個轉運過程[12-13]。Rab家族在酵母、哺乳動物和高等植物中具有高度的保守性[14]，為生物有機體囊泡轉運提供了一致的基礎。目前，擬南芥Rab蛋白家族已被鑒定和詳細分析。每個Rab成員約有200個氨基酸，并且序列具有高度相似性。所有Rab蛋白均具有5個典型的保守結構域，包括4個鳥嘌呤核苷酸結合結構域（G1、G3、G4和G5）與1個效應器結合結構域（G2）[3,15]。其中，G1是磷酸或Mg2+的結合位點，G4和G5是參與GTP-GDP結合和水解的關鍵位點。Rab在植物生長發育以及響應生物脅迫和非生物脅迫過程中發揮著重要的作用。例如，Rab蛋白影響著花粉管的生長[7]、葉片形態[16]、木質部發育[17]、自噬[18]、鹽分脅迫[19]和病原菌防御[16]等。小分子量GTP結合蛋白Rab6主要是調控囊泡從高爾基體到內質網的逆向運輸[20]。研究表明，AtRab6A與擬南芥根系發育密切相關[21]；OsRab6A參與調控水稻生長、糧食產量和鐵元素的積累以響應大氣中升高的CO2濃度[22]。

本研究以玉米ZmRab6A基因為研究對象，利用RT-PCR技術成功克隆了該基因的cDNA全長序列，并在DNA水平上分析了其基因結構。采用各種生物信息學軟件對其編碼蛋白ZmRab6A的理化性質、親/疏水性、保守結構域和二級結構等進行分析，結果表明，ZmRab6A基因cDNA全長1 044 bp，含有1個660 bp的開放閱讀框，編碼219個氨基酸；在DNA水平上，ZmRab6A基因含有6個外顯子和5個內含子，全長2 650 bp；ZmRab6A蛋白二級結構多為無規卷曲和α-螺旋，是一種無跨膜區域和信號肽的不穩定親水性胞質蛋白，具有G結構域和Rab6特異性位點，屬于P-loop_NTPase超家族蛋白。系統進化關系分析表明，玉米ZmRab6A與高粱、狗尾草和谷子中的親緣關系最近，這與植物分類地位一致。以上研究為后續探討ZmRab6A的生物學功能奠定了基礎。