茵陳蒿湯調控lncRNA PVT1/miRNA-30a-5p信號通路對重癥急性胰腺炎大鼠模型的保護作用

項 紅，胡鳳林,2，陶旭鋒，齊 心,2，張金楠,2，尚 東,1b,2

1 大連醫科大學附屬第一醫院 a.中西醫結合臨床重點學科實驗室, b.普外三科，遼寧 大連 116011；2 大連醫科大學 中西醫結合研究院，遼寧 大連 116044； 3 大連理工大學 化工學院，遼寧 大連 116024

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是以胰腺局部壞死和臟器功能衰竭為主要特征的消化系統疾病，其發病率和死亡率逐年升高[1]。SAP病理研究[2-3]表明，胰蛋白酶原的過度激活導致胰腺腺泡損傷和細胞壞死在SAP的發生發展中起著至關重要的作用。細胞凋亡維持細胞膜的完整性而無炎癥反應，但SAP胰腺腺泡細胞的凋亡延遲導致腺泡細胞晚期凋亡和壞死增加并釋放多種炎癥因子誘導炎性級聯反應，促進SAP重癥化演變[4]。因此，誘導受損的腺泡細胞從晚期凋亡向早期凋亡轉變可能減輕SAP的嚴重程度。近年來，細胞凋亡與自噬的相互調控引起了廣泛關注；研究[5]發現調節細胞自噬和凋亡的蛋白質網絡是高度相互關聯的。最新研究[6-8]表明miRNA在細胞凋亡和自噬之間的相互作用中起著重要的調控作用；長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可以作為一種miRNA競爭性的內源性RNA，參與生物調節過程[9]。然而，近年來關于lncRNA的研究大多集中在腫瘤上，在SAP中的作用研究還很少。茵陳蒿湯(YCHT)是由茵陳蒿、梔子和大黃組成的經典中藥復方，在亞洲作為抗炎和利膽藥已有數百年的歷史[10]。本課題組前期通過網絡藥理學發現YCHT通過誘導凋亡、抗炎、抗氧化和血脂調節發揮對SAP的保護作用[11]，但具體的分子機制還不明確。

1 材料和方法

1.1 材料 ?；悄懰徕c購自Solarbio (中國，北京)；酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒購自Lengton (中國，上海)；TUNEL檢測試劑盒購自美侖(中國，大連)；各類抗體購自Abcam (英國，劍橋)。RNA提取試劑盒、實時熒光定理PCR試劑盒購自TIANGEN(中國，北京)。

1.2 YCHT制備 YCHT由大連醫科大學第一附屬醫院藥劑科提供，其制備經過嚴格的質量控制。方法如下：將茵陳蒿在10倍于其質量的蒸餾水中浸泡1 h，然后煎煮40 min，加入梔子和大黃，煮沸15 min。收集濾液后，將殘渣浸泡在7倍于其質量的蒸餾水中，另外煎煮20 min。最后，將這兩次濾液混合并濃縮至0.25 g/ml。茵陳蒿∶梔子∶大黃的質量比為2∶1∶1。

1.3 分組及實驗模型建立方法 SD大鼠(雄性，200±20 g)購自大連醫科大學實驗動物中心[實驗動物生產許可證編號：SCXK(遼)2018-0003；實驗動物使用許可證編號：SYXK(遼)2018-0007]。將30只SD大鼠隨機分為3組：假手術(Sham operation,SO)組(n=10)、SAP模型組(n=10)和YCHT (4.0 g/kg)治療組(n=10)。根據既往方法建立實驗模型[12]：大鼠禁食12 h，自由飲水，然后通過腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)進行麻醉，經胰膽管逆行注射5.0%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g)建立SAP模型。模型建立成功后，治療組待大鼠麻醉蘇醒后每間隔6 h灌胃給予YCHT (4.0 g/kg)治療1次。SO組僅打開腹部作為對照。造模后24 h，取腹主動脈血進行生化分析，取胰頭標本固定在4%多聚甲醛中進行后續的組織病理學和免疫熒光分析；其他胰腺組織保存在-80 ℃，進行后續的實時熒光定量PCR和Western Blot等分析。

1.4 HE染色 取多聚甲醛固定后的胰腺組織進行石蠟包埋，并對切片進行蘇木精和伊紅(HE)染色，并在放大200倍的顯微鏡(Olympus BX53，日本)下進行觀察。

1.5 ELISA分析 采用ELISA試劑盒檢測血漿淀粉酶、TNFα和IL-1β水平。在450 nm處采用酶標儀(BioTek，美國)測量吸光度。

1.6 免疫熒光染色 胰腺切片脫蠟水合后，在4 ℃下與稀釋的兔源LC-3抗體(1∶100)孵育過夜，然后在37 ℃下與TRITC結合的山羊抗兔IgG(H+L)孵育1 h，并采用DAPI (5 μg/ml)復染5 min。最后在熒光顯微鏡(Olympus BX63，日本)200倍的視野下觀察拍照。根據LC-3蛋白的熒光強度和定位判斷胰腺組織的自噬情況。

1.7 TUNEL染色 采用TUNEL檢測試劑盒，按照說明書的方案進行細胞凋亡檢測。將胰腺組織切片與熒光素(紅色)標記的dUTP溶液在37 ℃的濕盒室中孵1 h，然后在熒光顯微鏡(Olympus BX63，日本)下觀察拍照。熒光圖像中陽性細胞(紅色)的數量代表細胞凋亡。

1.8 實時熒光定量qPCR 采用總RNA提取試劑盒從細胞和胰腺組織中提取總RNA樣品，并測定提取RNA的純度，然后采用PrimeScript RT試劑盒進行反轉錄。最后按照試劑盒說明書，采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)試劑盒進行基因的相對定量，以GAPDH和U6分別作為lncRNA PVT1和miRNA-30a-5p的內參，并計算基因的表達變化。基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 Western Blot 采用含1 mmol PMSF的預冷裂解緩沖液提取細胞和胰腺組織中的總蛋白樣品，并使用BCA蛋白檢測試劑盒定量蛋白濃度。采用SDS-PAGE(10%～15%)法分離蛋白質，并轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，采用兔LC-3、Beclin-1、XIAP、Caspase-3和NF-κB抗體(1∶1000)在4 ℃下孵育過夜，并用山羊抗兔IgG在室溫下孵育2 h (1∶2000)。最后，采用增強化學發光法在凝膠成像儀下檢測相應的蛋白表達。

1.10 倫理學審查 本研究方案經由大連醫科大學實驗動物倫理委員會審批，批號：AEE18072，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 YCHT減輕SAP誘導的大鼠胰腺損傷和炎癥反應

HE染色顯示SO組大鼠胰腺未見明顯病理損傷，而SAP模型組大鼠胰腺出現水腫、壞死、出血及炎性細胞浸潤；YCHT可明顯改善SAP誘導的胰腺病理損傷(圖1)。與形態學變化一致，胰腺組織病理學評分也顯示YCHT顯著減輕SAP誘導的胰腺損傷。ELISA結果表明，SAP模型組大鼠血漿淀粉酶、以及炎癥因子TNFα和IL-1β水平較SO組明顯升高，而YCHT可顯著降低其水平(表2)。這些結果證明YCHT能夠減輕SAP誘導的大鼠胰腺損傷和炎癥反應。

圖1 YCHT對SAP大鼠胰腺病理的影響(HE染色，×200)

2.2 YCHT誘導SAP大鼠胰腺細胞凋亡 如圖2所示，SAP模型組大鼠TUNEL陽性細胞(紅色)數量多于SO組，并且YCHT治療組的紅色熒光進一步增強，提示YCHT可增加TUNEL陽性細胞的數量，誘導損傷胰腺細胞發生凋亡。

圖2 SO組、SAP模型組和YCHT治療組胰腺組織TUNEL染色(紅色)典型圖像(×200)

2.3 YCHT抑制SAP大鼠胰腺細胞自噬 LC-3是外源性刺激后自噬啟動的一種特異性標志物。如圖3所示，免疫熒光結果表明，與SO組相比，SAP大鼠胰腺組織顯示更多的LC-3陽性區(紅色熒光)，但YCHT能夠明顯下調SAP誘導的LC-3蛋白表達，提示YCHT能夠抑制SAP大鼠胰腺細胞自噬。

表2 各組大鼠胰腺組織病理學評分以及血漿淀粉酶、TNFα、IL-1β水平的比較

圖3 SO組、SAP模型組和YCHT治療組胰腺組織LC-3蛋白表達(紅色)典型圖像(×200)

2.4 YCHT調節自噬和凋亡相關蛋白的表達 與SO組相比，SAP模型組LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值及Beclin-1、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)、Caspase-3和NF-κB蛋白表達明顯上調。然而，YCHT能夠顯著下調LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin-1、XIAP和NF-κB的表達水平，并進一步提高Caspase-3的表達水平(表3，圖4)，這些結果說明YCHT能夠抑制細胞自噬，同時誘導細胞發生凋亡。

表3 各組自噬和凋亡標記蛋白相對表達量的比較

注：1.SO組；2.SAP模型組；3.YCHT治療組

2.5 YCHT調控lncRNA PVT1/miRNA-30a-5p信號通路 SAP模型組lncRNA PVT1的表達水平明顯高于SO組，而miRNA-30a-5p的表達水平明顯低于SO組，但YCHT能夠顯著下調lncRNA PVT1以及升高miRNA-30a-5p的表達水平(表4)。

表4 YCHT對胰腺組織中lncRNA-PVT1和miRNA-30a-5p相對表達量的影響

3 討論

SAP病程復雜，其特征是胰腺腺泡細胞壞死，出現局部和全身炎癥[13]。胰腺腺泡細胞的早期凋亡被認為是SAP中的自我保護機制，與發生晚期凋亡的腺泡細胞相比，早期凋亡的誘導可能會降低SAP的嚴重程度[14-15]。研究[16]報道有利于誘導胰腺腺泡細胞早期凋亡的干預措施可以保護小鼠免受SAP的侵害。

自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程[17]。細胞自噬在SAP發病機制中是一種保護機制還是一種有害機制仍然是一個懸而未決的問題[18]。研究[5,19]報道細胞凋亡與細胞自噬之間相互調控，細胞自噬可以抑制細胞應激和化療后的細胞凋亡。此外，胰腺特異性自噬的過度激活引起腺泡細胞中酶原顆粒的大量積聚，進一步增加了SAP損傷[16]。本研究發現YCHT能夠減輕SAP誘導的大鼠胰腺損傷和炎癥反應；此外，采用免疫熒光和TUNEL法發現YCHT能夠顯著抑制SAP大鼠胰腺組織的細胞自噬以及增加細胞凋亡。

miRNA是一種非編碼的單鏈RNA，通過切割或翻譯抑制在動植物中調控基因表達[20]；miRNA作為生物過程的關鍵調控因子參與了多種疾病的發生發展[21-22]。miRNA-30a-5p是miRNA-30家族的成員，在細胞生長、分化和凋亡等過程中起著重要的調節作用[23]。據報道，miRNA-30a-5p在Ⅱ型糖尿病和胰腺導管腺癌的發發展中發揮著重要的作用[24-25]。本組前期研究[12]也發現SAP胰腺組織miRNA-30a-5p的表達異常，能夠靶向上調人絲氨酸蛋白酶(HtrA serine peptidase 1, HTRA1)基因，抑制TGFβ1介導的炎癥反應。此外，研究[26-27]發現miRNA-30a-5p通過直接與腫瘤細胞的3’-UTR區域序列結合，負性調節自噬基因Beclin-1和凋亡調節因子Bcl-2的表達，從而抑制自噬促進凋亡。

lncRNA的轉錄本長度超過200個核苷酸殘基，但不編碼蛋白質。最初被認為是基因組轉錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，沒有生物學功能[28]。然而，近年來研究發現lncRNA可以通過直接結合靶基因來激活或抑制靶基因的表達，并通過組蛋白修飾或募集轉錄因子來參與基因表達調控，或者作為一種miRNA競爭性的內源性RNA，參與生物調節過程[9]。本組前期研究中，基于生物信息學方法和雙熒光素酶報告基因檢測，發現lncRNA PVT1可能是一種內源性miRNA-30a-5p的競爭抑制劑，通過靶向調節lncRNA PVT1/miRNA-30a-5p信號通路介導的細胞凋亡和自噬可改善SAP。

中醫古籍中并無急性胰腺炎的相關記載，根據SAP腹痛、嘔吐、便結、黃疸等主要臨床表現，將其歸屬于中醫“腹痛”“脾心痛”“結胸”等范疇?？傮w來說，急性胰腺炎病性多為里、實、熱證，病機以肝膽氣機失調、濕熱蘊阻中焦、脾胃升降失常為要。其中，在急性胰腺炎的發病過程中，濕、熱、瘀是最關鍵的病理因素，因此清熱利濕、活血化瘀應作為最重要的治療原則貫穿始終。YCHT始見于漢代醫圣張仲景的《傷寒論》，主要病機是里熱熾盛、與濕相搏、壅滯中焦、瘀熱在里。通常認為，茵陳清熱利濕、疏肝利膽，為君藥；梔子清泄三焦濕熱，為臣藥；大黃瀉熱逐瘀、通降腑氣，為佐藥。近年來針對YCHT配伍機理進行了更深入的研究，研究認為在YCHT中，只有大黃既能清熱瀉火、活血化瘀，又可通利大便導濕熱而出，大黃相對于茵陳更符合“瘀熱在里”的病機。因此，在治療急性胰腺炎時，茵陳蒿湯中大黃可能起君藥作用，而茵陳、梔子對大黃有協同或相加效應。本研究發現，YCHT顯著減輕SAP誘導的胰腺組織病理損傷，降低SAP大鼠血漿淀粉酶、以及炎癥因子TNFα和IL-1β水平，抑制炎癥反應。機制研究發現，YCHT可通過抑制自噬和促進細胞凋亡減輕SAP損傷，其機制可能與調控lncRNA-PVT1/miRNA-30a-5p信號通路有關。這些數據也為中藥方劑YCHT的進一步開發提供了依據。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：項紅、胡鳳林負責課題設計，資料分析，撰寫論文；陶旭鋒參與收集數據，修改論文；齊心、張金楠協助收集數據，整理參考文獻；尚東負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。