珍稀植物日本莢蒾遺傳多樣性的ISSR分析

蔣明，應夢豪，徐麗娜，馬佳瑩，鄔張穎，楊如棉，朱欣，李彥蓉

（臺州學院生命科學學院,浙江椒江318000）

莢蒾屬（Viburnum）隸屬忍冬科（Caprifoliaceae），為灌木或小喬木，落葉或常綠。莢蒾屬植物在全世界約有200種，分布于溫帶和亞熱帶地區，我國約有73種，其中45種為我國特有種［1］。日本莢蒾（V.japonicum）為常綠植物，葉片革質，呈卵型、近卵型或寬倒卵型，葉片表面呈深綠色，背面淺綠且葉脈突出；花序復聚傘形，花色潔白，果熟時鮮紅色，具有較高的觀賞價值（見圖1）［2］。日本莢蒾大多生長在海島山坡林下、雜木林或亂石堆中，數量十分稀少。日本莢蒾為中國-日本間斷分布種，在韓國、日本等近海地區亦有發現，我國臺灣北部海岸也有少量分布，大陸僅見于浙江舟山東福山島、臺州大陳島、臨海頭門島、田岙島和雀兒岙島等地［3-4］。近年來，隨著浙江東部海島的旅游開發，部分海島植物的生境遭到一定程度的破壞，日本莢蒾現已被列入《浙江省重點保護野生植物名錄》（第一批），是極小種群拯救保護物種之一［5］。

圖1 日本莢蒾Fig.1 Viburnum japonicum

與形態學、細胞學及生理生化標記相比，分子標記十分穩定，不受材料環境和發育階段的影響，近年來，在遺傳多樣性、親緣關系分析、種質資源鑒定、基因定位和遺傳圖譜構建等研究中得到廣泛應用［6］。簡單序列重復區間擴增多態性（inter-simple sequence repeat，ISSR）是由 ZIETKIEWICZ 等［6］基于簡單序列重復（simple sequence repeats，SSR）建立的一種新型分子標記技術，其在SSR的3’或5’端加上2～4個錨定核苷酸，以提高反應的專一性，PCR產物經電泳分析后可獲得遺傳多樣性信息［7］。ISSR技術具有操作簡便、重復性好和多態性高等優點，在遺傳多樣性研究中應用較廣［8］。對日本莢蒾的已有研究僅見于生理生化、扦插繁殖和化學組成等方面，對分子層面的遺傳多樣性研究未見報道［9-11］。本研究在調查和搜集日本莢蒾種質資源的基礎上，用ISSR技術對基因組DNA進行PCR擴增，旨在揭示不同地理來源日本莢蒾的遺傳多樣性水平，為該物種的保護和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

日本莢蒾葉片采自上大陳島（SDC）、頭門島（TM）、雀兒岙島（QEA）和東福山島（DFS）4個樣地，共8個居群、125份樣品。日本莢蒾在TM分布極其稀少，僅發現一個居群，其余樣地均有多個居群，各居群的地理位置信息見表1。采集時，選擇莖干直徑3 cm左右且間隔在20 m以上的植株樣品，選取健康的日本莢蒾葉片置于冰盒，帶回實驗室后用無菌水清洗，自然風干后保存于-80℃的超低溫冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取

將日本莢蒾葉片置于研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用SDS法提取基因組DNA。用1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳檢測提取結果，用美國伯樂Gel Doc XR+凝膠成像系統拍照記錄，將DNA溶液置于-20℃的冰箱中保存備用。

1.2.2 ISSR-PCR擴增

依據不列顛哥倫比亞大學（The University of British Columbia，UBC）公布的100條ISSR通用引物，以日本莢蒾DNA為模板，用伯樂C1000型PCR儀進行ISSR通用引物的篩選和體系程序優化。選取多態性高、重復性好的引物，對DNA模板的濃度、引物用量和反應溫度等進行優化。根據已優化的體系和程序，用篩選得到的引物對所有日本莢蒾樣品進行ISSR-PCR擴增。將PCR產物點樣置于1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）中，電壓和電流分別設置為125 V與55 mA，電泳40 min，用凝膠成像系統觀察，并拍照記錄。

表1 日本莢蒾居群的采樣位置信息Table 1 Sampling information of Viburnum japonicum populations

1.2.3 數據分析

以ISSR-PCR照片為依據，用Excel表統計譜帶數量，有譜帶處標“1”，無譜帶處標“0”，建立0/1矩陣；用POPGEN 32軟件計算Nei’s基因多樣性指數（Nei"s gene diversity index，H）和 Shannon’s信息指數（Shannon"s information index，I）等遺傳參數；用NTSYS 2.10軟件對125個樣品進行聚類分析，繪制親緣關系樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 樣品采集

日本莢蒾的數量十分稀少，僅零星分布于頭門島、上大陳島、雀兒岙島和東福山島等地，其中頭門島為日本莢蒾的新分布點，植株稀少，不足30株，而上大陳島的植株相對較多。日本莢蒾伴生植物主要有柃木（Eurya japonica）、天仙果（Ficus erectavar.beecheyana）、龍須藤（Bauhinia championii）、菝葜（Smilax china）、濱 柃（Eurya emarginata）、海 桐（Pittosporum tobira）、鱔藤（Anodendron affine）、海州 常 山（Clerodendrumtrichotomum）和 野 桐（Mallotus japonicusvar.floccosus）等。

2.2 ISSR-PCR擴增

2.2.1 ISSR擴增結果

經優化，獲得最佳反應體系：2.0 μL 10× Taq Plus PCR 緩沖液（含 20 mmol·L-1Mg2+），0.5 μL DNA 模 板（50 ng·μL-1），0.5 μL 引 物 ，0.5 μL dNTPs，0.4 μL Taq DNA 聚 合 酶 ，ddH2O 補 至20 μL。PCR程序設置：94℃預變性300 s；94℃變性45 s，55.4℃退火45 s，72℃延伸120 s，共39個循環；72℃延伸600 s。取部分DNA樣品，將其作為模板進行引物篩選，選取UBC835、UBC836、UBC840、UBC841、UBC842、UBC895和 UBC899共7條多態性高、譜帶清晰且重復性好的引物。

采用優化后的反應體系與程序，用7條引物對125份樣品進行ISSR-PCR擴增實驗，共得到240條譜帶，平均每條引物擴增出34.29條譜帶，其中多態性譜帶232條。引物UBC895擴增得到的譜帶最多，為39條，多態性位點百分比（PPB）為94.87%；引物UBC835擴增出的譜帶最少，僅29條，PPB為89.66%；PPB最高的引物為UBC840、UBC842和UBC899，達100%，說明ISSR標記擴增效率較高且多態性較好，其中引物UBC899對部分日本莢蒾樣品的ISSR擴增圖譜見圖2。

2.2.2 居群的遺傳多樣性

對ISSR-PCR譜帶數據進行分析，得到遺傳多樣性指數（見表2）。在物種水平上，日本莢蒾的PPB為96.67%，H為0.227 3，I為0.358 1。在居群水平上，各居群間PPB差異較大，介于21.67%和40.00%之間，TM樣地最高，DFS-1次之，SDC-2最低，平均值為32.61%；H的變化范圍為0.073 1～0.136 3，平均值為0.108 8；I的變化范圍為0.109 2～0.205 1，平均值為0.164 2，8個居群的PPB、H和I均低于物種水平。在8個居群中，TM樣地的PPB、I和H均為最大，居群內多樣性水平最高；SDC樣地的3個居群，遺傳多樣性水平相對較低。

2.2.3 居群間的遺傳距離與遺傳分化

用POPGENE 32軟件計算居群間遺傳距離與遺傳一致度，結果表明，各居群的遺傳距離為0.098 2～0.254 0，遺傳一致度為 0.775 7～0.906 4（見表3）。由表3可知，QEA-1和SDC-3之間的遺傳距離最大，DFS-1和DFS-2之間的遺傳距離最小。DFS-1和DFS-2的遺傳一致度最高，達0.906 4；QEA-1和SDC-3的遺傳一致度最低，僅為0.775 7。居群間基因分化系數（Gst）為 0.527 1，即居群間存在52.71%的遺傳變異，遺傳分化較大。8個居群間基因流（Nm）為0.448 7，基因交流相對較少。

圖2 引物UBC899對部分日本莢蒾樣品的ISSR擴增圖譜Fig.2 ISSR amplification profiles of Viburnum japonicum samples with primer UBC 899M：DNA標準分子量；1～12：12個樣品的ISSR-PCR產物M：DNA marker；1-12：ISSR-PCR products of 12 samples

表2 日本莢蒾居群的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity of Viburnum japonicum populations

表3 日本莢蒾8個居群的遺傳距離和遺傳一致度Table 3 Genetic distance and Nei"s genetic identity of eight Viburnum japonicum populations

2.2.4 聚類分析

為進一步探討日本莢蒾8個居群間的遺傳關系，用NTSYS 2.1軟件進行聚類分析（見圖3）。由圖3可知，當遺傳一致度為0.709 0時，8個居群可分為4大類：SDC-1、SDC-2和SDC-3為一類，與地理位置密切相關；QEA-2、DFS-1和DFS-2為一類，TM和QEA-1各成一類。8個居群均表現出明顯的地域性規律，來自同一樣地的居群大多聚為一類，但也有來自不同樣地的居群聚為一類的。因QEA-1與其他居群遺傳差異大，親緣關系較遠，單獨歸為一類。

圖3 日本莢蒾8個居群的聚類分析Fig.3 The dendrogram of eight populations Viburnum japonicum

3 討 論

常見的分子標記有隨機擴增多態性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）和ISSR等，每種標記各有優缺點［12］。近年來，科研人員利用ISSR分子標記開展了大量遺傳多樣性研究。開展物種遺傳多樣性和遺傳結構等方面的研究，是探討物種適應性和生存能力的基礎，也是分析物種瀕危原因的基礎，有助于制定科學有效的保護策略和措施。為開展對珍稀植物楊葉肖槿（Thespesia populnea）的種質資源保護，張永夏等［13］建立了楊葉肖槿ISSR-PCR最適反應體系。段帆等［14］利用ISSR對174份水青樹（Tetracentron sinense）種質資源進行PCR擴增，為構建78份核心種質提供了數據支持。李群等［15］利用ISSR和AFLP 2種分子標記技術對延齡草（Trillium tschonoskii）的7個自然居群的遺傳多樣性和居群結構進行了研究，結果顯示，生境破壞、居群間遺傳分化程度高和遺傳多樣性水平低是延齡草瀕危的主要原因。

地理分布受限的珍稀瀕危植物遺傳多樣性通常較低，冷欣等［16］利用 ISSR對全緣冬青（Ilex integra）的6個居群進行了研究，結果表明，全緣冬青的遺傳多樣性較低。史艷財等［17］對小花異裂菊（Heteroplex microcephala）進行ISSR-PCR擴增，結果表明，PPB為30.21%，H為0.105 4，I為0.154 6，其在物種水平上遺傳多樣性較低。近年來，大量研究證明，一些珍稀瀕危植物亦具有較高的遺傳多樣性，數量稀少并不一定意味著其遺傳多樣性水平低［18］。 張穎娟等［19］對珍稀瀕 危小灌木長 葉紅砂（Reaumuria trigyna）的研究結果表明，該物種雖然數量不多但遺傳多樣性水平較高。金則新等［20］對瀕危植物夏蠟梅（Calycanthus chinensis）的分析發現，其在物種水平上遺傳多樣性高，在居群水平上遺傳多樣性較低。本研究也得到類似結果，在物種水平上，日本莢蒾的PPB高達96.67%，I為0.358 1，H為0.227 3，遺傳多樣性高；而在居群水平上，日本莢蒾的PPB平均值為32.61%，I平均值為0.164 2，H平均值為0.108 8，遺傳多樣性相對偏低，居群內遺傳衰退的原因可能與遺傳漂變、有效規模下降及自交親和等有關［21］。

日本莢蒾居群間Gst為0.527 1，即居群間存在52.71%的變異，居群內存在47.29%的變異，遺傳變異大部分出現在居群間。日本莢蒾的居群數量和規模較小，基因流被海島山和島嶼間距離阻遏，本地居群內近交和遺傳漂變上升，導致居群內遺傳多樣性降低，居群間出現較大的遺傳分化現象［22-24］。WRIGHT［25］認為，當Nm值大于 1時，居群間遺傳分化才能發揮均質化作用，若Nm值小于1，則表明基因流動受限，導致居群間遺傳分化增大。影響植物居群間遺傳分化的因素很多，KWON等［26］認為，島嶼間的地理隔離會限制花粉及種子傳播的范圍，導致居群間出現較大的遺傳分化。本研究中的日本莢蒾，居群間Nm僅為0.448 7，推測其與日本莢蒾的生長環境有關。野外調查發現，日本莢蒾生長于灌木叢中，在一定程度上限制了種子和花粉的傳播。此外，8個日本莢蒾居群分布于相距較遠的4個海島，地理隔離導致的基因流受限可能是居群間遺傳分化較高的主要原因。日本莢蒾遺傳距離聚類分析結果顯示，除QEA樣地的2個居群歸屬不同類外，其余分布于同一島嶼的居群均歸屬同一聚類，表明日本莢蒾的遺傳相似性與地理位置呈較明顯的相關性。QEA樣地的2個居群雖然處于同一海島，但被高大的山坡阻擋，推測山坡的天然屏障作用是2個居群出現高度遺傳分化的原因。

4 結 論

在野外調查的基礎上，對8個居群共125份日本莢蒾樣品進行ISSR遺傳多樣性分析。日本莢蒾植株十分稀少，據初步統計，數量不足1 000株，TM樣地是新分布點，數量不足30株，該物種亟待保護；從100條ISSR通用引物中篩選出7條引物用于PCR擴增，獲得了日本莢蒾8個居群的遺傳多樣性相關數據。TM樣地的遺傳多樣性最高，SDC樣地的遺傳多樣性最低，同一地理來源的日本莢蒾大多聚為一類，呈現一定的地域分布規律；日本莢蒾的遺傳多樣性較高，但主要存在于居群間，島嶼間的地理隔離可能是遺傳分化的主要原因。基于研究結果，建議對日本莢蒾采取以下保護措施：（1）日本莢蒾居群數量少但遺傳分化高，任一居群內少數個體的丟失均可能導致基因漂變，須就地保護，并建立種質資源庫；（2）在開發海島的同時，應兼顧保護日本莢蒾的自然生境；（3）通過人工授粉，增加日本莢蒾后代的基因雜合度；（4）通過居群間種苗的相互遷移返種。