四川石渠縣牦牛源蜱的形態學及分子生物學鑒定

鄧兵，唐天才，向陽

（1.四川省綿陽市安州區動物疫病預防控制中心，四川 安州 622650；2.宜賓學院，四川 宜賓 644000；3.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

石渠縣地處青藏高原東部，四川省西北部，是草地資源豐富的純牧業縣，牦牛飼養規模居全省前列[1]。蜱蟲是當地牦牛體表最為常見的體外寄生蟲，也是多種病毒、細菌、螺旋體、立克次氏體和原蟲的貯存宿主及傳播媒介[2-3]。

蜱蟲的鑒定通常借助于光學顯微鏡觀察，但僅通過傳統的形態學鑒定方法難以對其進行準確鑒定[4]。近年來，隨著分子生物學的快速發展，對蜱蟲的鑒定多采用形態學加分子生物學相結合的手段。石渠縣當地牧民與牦牛接觸密切，存在被蜱蟲叮咬而感染蜱傳疾病的風險。因此，開展石渠縣牦牛源蜱的鑒定對防控當地動物疾病和人畜共患病具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 2018 年3～8 月，分別在石渠縣阿日扎鄉、麻呷鄉、長須干瑪鄉和德榮瑪鄉4個鄉的牦牛體表采集蜱蟲。為了讓樣本具有代表性，采集樣本時應在不同的鄉選取2～3個不相鄰的村，每個村選擇2～3個不相鄰的牦牛群。從每頭牦牛體表采集蜱蟲5～6 只，裝入收集管后5 d內送至西南民族大學獸醫寄生蟲實驗室，經形態學鑒定后加入75%乙醇溶液，置4 ℃冰箱中冷藏待檢。

1.1.2 主要試劑 組織基因組DNA 提取試劑盒（EasyPure Genomic DNA Kit）；Trans 2K Plus DNA marker、2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金公司）。引物合成及測序均由生工生物工程技術服務有限公司（成都公司）完成。

1.1.3 主要儀器 Leica 體式顯微鏡（S9D），Bertin Precellys 24 研磨器，Eppendorf 臺式高速離心機（5402 型），Bio-Rad 伯樂梯度PCR 擴增儀（RTC240型），北京六一儀器廠電泳儀（DYY-6），全自動數碼凝膠圖像分析系統（Tanon 5200 Multi）。

1.2 方法

1.2.1 形態學分類 根據《中國經濟昆蟲志》（第十五冊）[5]和《中國畜禽寄生蟲形態分類圖譜》[6]中對蜱蟲形態學的描述，使用體式顯微鏡分別對雌蜱和雄蜱進行形態學鑒定。主要對蜱蟲的背面、腹面、假頭、假頭基、盾板、雄蜱肛側板、雌蜱孔區、氣門板和生殖孔進行觀察，并做好記錄。經形態學初步鑒定后，選取其中20%形態結構不同且采樣點不同的蜱進行分子生物學鑒定。

1.2.2 DNA 提取 從75%酒精溶液中取出待檢蜱蟲樣本，用無菌生理鹽水反復洗滌3次，用吸水紙擦干后沿蜱的縱向中軸線切開。其中半只放入-80 ℃冰箱內保存，余下半只置于研磨器中加入500 μL 無菌水進行充分研磨。研磨器設置參數如下：每管加入直徑0.5 mm 和2 mm 的陶瓷珠20珠和5珠，5 500 r∕min研磨2次，4 000 r∕min研磨1 次。取200 μL 研磨液，按照EasyPure Genomic DNA Kit 試劑盒說明書中的方法提取蜱DNA，置-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 PCR 檢測 參照Ondrejicka 等[7]報道的方法對蜱進行分子鑒定，引物信息見表1。

表1 PCR引物信息

PCR 擴增體系如下：模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，充分混勻。設陽性對照和陰性對照（去離子水）。蜱COI 基因擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，40 個循環；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫。

1.2.4 序列分析及統計分析 將全部陽性樣品送至生工生物工程公司測序，使用DNA Star軟件對所得全部序列進行拼接分析，在NCBI 網站中使用BLAST 進行比對，再使用MEGA 6.0 軟件以Neighbor-Joining 法（Bootstrap 值1 000）構建分子進化樹。

2 結果

2.1 樣本采集數量及形態學鑒定 在阿日扎鄉、德榮瑪鄉、麻呷鄉和長須干瑪鄉分別采集到成蜱168 只、192 只、224 只和234 只，共818只。經形態學初步鑒定，本次采集的蜱蟲有2個種，分別是青海血蜱和西藏革蜱，形態學特征見表2。其中青海血蜱的比例為21.03%（172∕818），西藏革蜱的比例為78.97%（646∕818），見表3。

表2 青海血蜱和西藏革蜱的形態學特征

表3 采樣點的蜱種類及數量只

2.2 蜱的分子鑒定

2.2.1 蜱COI 基因擴增 以提取的蜱DNA 為模板，采用常規PCR方法擴增蜱的線粒體細胞色素C 氧化酶亞基I（COI）基因片段，結果在658 bp 左右處出現條帶，與預期片段大小相符。詳見圖1。

圖1 蜱COI基因擴增結果

2.2.2 蜱COI 基因遺傳進化分析 將測序所得的全部序列進行拼接、比對后共得到5 條序列，其中1條為青海血蜱（H.qinghaiensis.Shiqu），其余4 條為西藏革蜱（D.everestianus.Shiqu 1、D.everestianus.Shiqu 2、D.everestianus.Shiqu 3、D.everestianus.Shiqu 4）。選取經BLAST 比對后同源性最高的1～2 條序列已確定種（即青海血蜱及西藏革蜱），在NCBI中選取分離自不同地區的青海血蜱和西藏革蜱的COI 基因序列，再選取幾個其他種的血蜱和革蜱的COI基因序列作為參考序列，構建分子進化樹（見圖2）。從圖可知，分離株D.everestianus.Shiqu 1、D.everestianus.Shiqu 2、D.everestianus.Shiqu 3、D.everestianus.Shiqu 4與西藏革蜱（KJ396938）聚為一支，同源性達98.0%～99.5%。分離株H.qinghaiensis.Shiqu與甘肅天祝青海血蜱分離株（MF981066）和甘肅臨洮青海血蜱分離株（MF981034）聚為一支，同源性達99.09% ；與青海湟源青海血蜱分離株（MF981069）、甘肅永靖青海血蜱分離株（MF982056）的同源性分別達98.63%、98.48%。

圖2 蜱COI基因系統進化樹分析

3 討論

通過光學顯微鏡或掃描電子顯微鏡對蜱進行形態學鑒定的傳統方法易受主觀因素的影響，且難以對某些形態學特征相似的蟲種進行準確區分[8]。近年來，隨著分子生物學技術的快速發展，該技術已被廣泛運用于寄生蟲的蟲種鑒定。通過PCR 擴增及測序，可在基因水平上對蜱種進行鑒定，具有特異性強、準確度高等優點。本研究就采用形態學加分子生物學相結合的方法對石渠縣牦牛體表寄生的蜱進行了蟲種鑒定。

COI 基因是線粒體DNA 上一段保守的蛋白質編碼基因，近年來被廣泛運用于寄生蟲的種類鑒定[9]。本研究以蜱COI 基因序列設計引物，經普通PCR 鑒定，對測序結果進行分析，結果表明石渠縣牦牛體表寄生的蜱蟲為青海血蜱和西藏革蜱，其中青海血蜱的占比為21.03%，西藏革蜱的占比為78.97%。說明西藏革蜱是石渠縣牦牛體表寄生蜱的優勢蟲種，這可能與西藏革蜱和青海血蜱的生活習性、采集地的海拔、降雨量、氣候等因素有關。在本次調查的4 個鄉中，僅麻呷鄉鑒定出了青海血蜱，可能與當地氣候、海拔和驅蟲藥的使用等因素有關。

4 結論

本研究對石渠縣牦牛源蜱開展了形態學鑒定和分子生物學鑒定，鑒定結果表明，石渠縣存在青海血蜱和西藏革蜱，其中西藏革蜱是當地牦牛體表寄生蜱的優勢蟲種。接下來筆者建議進一步擴大石渠縣家畜體表蜱的調查范圍和樣本采集數量，以期為石渠縣動物疾病及人畜共患病的防控提供更確實的數據。