一種可調(diào)固定式金標(biāo)卡定量?jī)x的研制

詹銘，龐春穎，鄭伯明

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

膠體金是一種應(yīng)用于抗原抗體的新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，膠體金法研制出的金標(biāo)檢測(cè)卡是將膠體金作為示蹤標(biāo)志物標(biāo)記在抗原或抗體上，通過(guò)與被測(cè)物的抗體或抗原發(fā)生特異性免疫結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)的金標(biāo)復(fù)合物，進(jìn)而對(duì)待測(cè)物做出定性判斷［1-3］。隨著電子信息技術(shù)智能化發(fā)展，為滿足對(duì)檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)需求，國(guó)內(nèi)外研究人員開(kāi)發(fā)多款基于金標(biāo)卡檢測(cè)結(jié)果的定量分析儀，依據(jù)定量檢測(cè)方法的不同，可分為以下幾種［4］，如表 1所示。

表1 檢測(cè)方法比較

通過(guò)比較以上三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)采用光電檢測(cè)法，完成系統(tǒng)搭建。其檢測(cè)原理為光源發(fā)出的光照射在金標(biāo)卡上，根據(jù)金標(biāo)卡顯色條帶顏色差異，導(dǎo)致對(duì)光線出現(xiàn)不同程度的反射與吸收，反射光被光電探測(cè)器采集，引起荷電量的變化，從而產(chǎn)生感應(yīng)電流，通過(guò)檢測(cè)電流大小和相應(yīng)的計(jì)算，實(shí)現(xiàn)對(duì)金標(biāo)卡定量檢測(cè)［5］。

1 系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)

金標(biāo)卡定量?jī)x的系統(tǒng)設(shè)計(jì)分為4大功能模塊，分別為光電檢測(cè)模塊，信號(hào)處理模塊，STM32中央控制模塊，人機(jī)交互部分［6］。光電檢測(cè)模塊實(shí)現(xiàn)了對(duì)金標(biāo)卡顯色區(qū)域信息的提取，信號(hào)處理模塊負(fù)責(zé)對(duì)采集到的信號(hào)進(jìn)行調(diào)理，STM32中央控制模塊實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)各功能模塊的控制以及對(duì)待測(cè)物定性分析與定量計(jì)算。人機(jī)交互部分由微型串口打印機(jī)、TFTLCD顯示屏、功能按鍵組成，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果顯示與打印。系統(tǒng)總體方案如圖1所示。

圖1 系統(tǒng)總體方案結(jié)構(gòu)框圖

1.1 光電檢測(cè)模塊

光電檢測(cè)模塊作為系統(tǒng)信號(hào)來(lái)源，是整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的重要組成部分，由光源，光電探測(cè)器，掃描導(dǎo)軌，通光孔構(gòu)成。光電探測(cè)器位于通光孔正上方，入射光照射在金標(biāo)卡上發(fā)生漫反射，反射光穿過(guò)通光孔被正上方的光電探測(cè)器采集［7］。金標(biāo)卡顯色線為紅棕色，依據(jù)光吸收原理，紅色物質(zhì)對(duì)于綠色光源具有較強(qiáng)吸收峰值，因此采用四個(gè)綠色LED作為光源，置于通光孔的四方位，呈環(huán)形分布［8］。相比于兩側(cè)放置，一方面此方法照射在檢測(cè)卡上的光均勻分布，待檢測(cè)區(qū)域覆蓋全面，使顯色線對(duì)光吸收更加完整，另一方面光源光強(qiáng)的提高，反射光強(qiáng)隨之增強(qiáng)，更有利于光電探測(cè)器采集微弱反射光信號(hào)，提高了檢測(cè)系統(tǒng)精確性，光電檢測(cè)模塊結(jié)構(gòu)如圖 2 所示［9］。

圖2 光電檢測(cè)模塊結(jié)構(gòu)圖

1.2 信號(hào)處理電路設(shè)計(jì)

信號(hào)處理電路由I/V轉(zhuǎn)換電路與放大濾波電路組成，由于光電探測(cè)器接收到的光信號(hào)與輸出的電流信號(hào)呈非線性關(guān)系，與輸出的電壓信號(hào)呈較好的線性關(guān)系，因此采用I/V轉(zhuǎn)換電路將電流信號(hào)轉(zhuǎn)為電壓信號(hào)，通過(guò)放大電路對(duì)電壓信號(hào)進(jìn)一步放大，以達(dá)到AD檢測(cè)的閾值范圍。為了濾除信號(hào)中干擾與噪聲，采用2階有源低通濾波電路對(duì)放大后的信號(hào)值進(jìn)行處理，截止頻率設(shè)為2 Hz，信號(hào)處理電路原理圖如圖3所示。

1.3 步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路設(shè)計(jì)

由于通光孔的通光口徑有限，掃描時(shí)需試紙條緩慢通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，以便獲取紙條檢測(cè)區(qū)完整數(shù)據(jù)。步進(jìn)電機(jī)具有運(yùn)行平穩(wěn)、精確定位的優(yōu)點(diǎn)，采用兩相四線式永磁步進(jìn)電機(jī)作為傳動(dòng)源，穩(wěn)定性強(qiáng)且體積較小，步距角3.6°，步長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的線位移量為0.012 7 mm，控制精度高，適用于系統(tǒng)精準(zhǔn)定位［10］。

圖4 步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路圖

步進(jìn)電機(jī)正常工作所需額定功率較大，因此需要驅(qū)動(dòng)電路對(duì)輸入低功率邏輯電平功率放大，文中選用L298N驅(qū)動(dòng)模塊，L298N作為一款雙全橋大電流電機(jī)驅(qū)動(dòng)芯片，驅(qū)動(dòng)部分峰值電流可達(dá)2 A，啟動(dòng)性能好，轉(zhuǎn)換效率高，發(fā)熱量小，具備更強(qiáng)的帶負(fù)載能力。以4路不同相位PWM波作為邏輯輸入，驅(qū)動(dòng)穩(wěn)定性好，不占用運(yùn)行資源，通過(guò)定時(shí)器溢出中斷脈沖計(jì)數(shù)的方式精確控制位移量，實(shí)現(xiàn)對(duì)金標(biāo)卡有效區(qū)域精準(zhǔn)檢測(cè)，步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路原理圖如圖4所示。由于步進(jìn)電機(jī)有著與電感相似的性質(zhì)，在電源斷開(kāi)時(shí)發(fā)生自感，產(chǎn)生的自感電壓易擊穿電路元件，D11-D18為8個(gè)續(xù)流二極管，作為自感電壓的釋放路徑，對(duì)每個(gè)輸出口起續(xù)流保護(hù)的作用。

1.4 人機(jī)交互部分

（1）微型串口打印機(jī)

嵌入式微型熱敏打印機(jī)串行接口與RS232C標(biāo)準(zhǔn)兼容，識(shí)別EIA邏輯電平，而STM32串行接口輸出的打印指令與數(shù)據(jù)為T(mén)TL邏輯電平，無(wú)法被打印機(jī)直接識(shí)別，因此需通過(guò)電平轉(zhuǎn)化芯片，將TTL電平轉(zhuǎn)化為EIA電平，驅(qū)動(dòng)微型熱敏打印機(jī)［11］。研究選用SP3232電平轉(zhuǎn)化芯片，傳輸率120 kps，功耗低，供電電壓為3.3 V時(shí)，耗電量?jī)H為0.3 mA，使用方便且性價(jià)比高，串口打印機(jī)驅(qū)動(dòng)電路原理圖如圖5所示。

圖5 串口打印驅(qū)動(dòng)電路圖

（2）功能按鍵

為簡(jiǎn)化系統(tǒng)操作流程，系統(tǒng)檢測(cè)、打印、歷史查詢通過(guò)功能按鍵進(jìn)行控制，一鍵完成。系統(tǒng)功能按鍵與I/O口一對(duì)一直接連接，按鍵對(duì)應(yīng)STM32的I/O口輸入端常態(tài)為高電位，按鍵按下輸入端轉(zhuǎn)變?yōu)榈碗娢唬存I間相互獨(dú)立，通過(guò)讀取電平的變化檢測(cè)相應(yīng)按鍵操作，電路連接原理圖如圖6所示。

圖6 功能按鍵電路圖

（3）LCD顯示屏

TFTLCD顯示屏的增設(shè)為用戶提供良好的人機(jī)交互體驗(yàn)，可實(shí)時(shí)觀察采集到的數(shù)據(jù)，顯示檢測(cè)結(jié)果與歷史檢測(cè)數(shù)據(jù)。為提高顯示屏的顯示速度，系統(tǒng)采用STM32特有的片上外設(shè)FSMC接口模擬8080并口時(shí)序，驅(qū)動(dòng)液晶控制器NT35510進(jìn)而控制TFTLCD顯示屏顯示。TFTLCD16位的并方式與FSMC連接，其電路原理圖如圖7所示。

圖7 LCD顯示屏電路圖

1.5 電源模塊電路設(shè)計(jì)

為系統(tǒng)各功能部分正常工作提供穩(wěn)定可靠輸入電壓，根據(jù)各功能模塊所需電壓不同，需要提供+12 V、±9 V、+5 V、+3.3 V電壓，系統(tǒng)采用12 V鋰電池外部供電，電源模塊電路由電壓極性反轉(zhuǎn)電路與穩(wěn)壓電路組成。電源模塊電路示意圖如圖8所示。

圖8 電源模塊電路示意圖

穩(wěn)壓電路的設(shè)計(jì)為運(yùn)算放大器與串口打印機(jī)提供所需的+9 V電壓，采用GS2678異步直流降壓變換器，該變壓器可調(diào)輸出電壓范圍大，調(diào)節(jié)方法簡(jiǎn)單，通過(guò)R2與R3比值調(diào)節(jié)控制輸出電壓值，為系統(tǒng)所選用。步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)模塊與顯示屏所需電壓為+5 V，中央控制模塊所需電壓為+3.3 V，出于低壓狀態(tài)下對(duì)系統(tǒng)穩(wěn)定效果的考慮，選用AMS1117-3.3與AMS1117-5.0正向低壓降穩(wěn)壓器固定輸出版本，其漏失電壓低，穩(wěn)定精度可達(dá)1%，固定輸出3.3 V與5 V電壓。穩(wěn)壓電路原理圖如圖9所示。

極性反轉(zhuǎn)電路為雙極性放大器工作提供所需負(fù)電壓。電能轉(zhuǎn)換率是放大器穩(wěn)定工作的重要保證，所選用的極性反轉(zhuǎn)芯片為ICL7660高效率DC/DC電壓變化器，空載的轉(zhuǎn)化率為99.7%，帶負(fù)載的轉(zhuǎn)化率為95%，正電壓輸入范圍為1.5～10.5 V，輸出電流為10～20 mA，滿足設(shè)計(jì)要求。其電路原理圖如圖10所示，使用C42、C43兩個(gè)10 μF小體積泵電容可完成電壓極性反轉(zhuǎn)效果，C41主要起到濾除雜訊的目的。

圖9 穩(wěn)壓電路原理圖

圖10 極性反轉(zhuǎn)電路原理圖

1.6 彈簧卡座設(shè)計(jì)

根據(jù)市面上不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)金標(biāo)卡無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，尺寸類(lèi)型多樣，為解決定量?jī)x插卡口在檢測(cè)時(shí)受到寬度限制造成的局限性，同時(shí)避免檢測(cè)時(shí)金標(biāo)卡產(chǎn)生晃動(dòng)，因此在插卡口設(shè)計(jì)一種彈簧卡座，將金標(biāo)卡固定在掃描導(dǎo)軌上，提高了系統(tǒng)準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多尺寸金標(biāo)卡的檢測(cè)。適用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品安全、農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域常見(jiàn)2～2.5 cm寬度的金標(biāo)卡檢測(cè)。彈簧卡座如圖11所示，系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)如圖12所示。

圖11 彈簧卡座

圖12 系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)

2 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

2.1 算法選擇

使用光電探測(cè)器作為傳感器，利用金標(biāo)卡顯色深淺的差異所得到的光信號(hào)強(qiáng)弱的不同來(lái)進(jìn)行定量分析，目前對(duì)于濃度定量分析計(jì)算有極值法與面積法兩種，極值法的建立是通過(guò)尋求T線與C線的波谷值進(jìn)行計(jì)算求解待測(cè)物的濃度值。面積法的建立是通過(guò)對(duì)T線波形與C線波形面積求積分進(jìn)行計(jì)算求解待測(cè)物的濃度值，極值法與面積法示意圖如圖13所示［12］。

圖13 極值法與面積法示意圖

由于面積法對(duì)于有效數(shù)據(jù)提取完整，經(jīng)過(guò)大量采樣數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算而得，引入誤差小，算法準(zhǔn)確度高，因此本系統(tǒng)選用的面積法進(jìn)行數(shù)據(jù)提取計(jì)算，系統(tǒng)對(duì)金標(biāo)卡檢測(cè)信號(hào)波形圖如圖14所示。

圖14 金標(biāo)卡檢測(cè)信號(hào)波形圖

2.2 建立曲線模型

本研究所選取的檢測(cè)物質(zhì)為三聚氰胺，因此實(shí)驗(yàn)中配置不同濃度梯度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，并使用金標(biāo)卡對(duì)其檢測(cè)，根據(jù)不同濃度樣品液所產(chǎn)生的T線信號(hào)與C線信號(hào)比值進(jìn)行標(biāo)定，以建立對(duì)應(yīng)的函數(shù)濃度曲線［13］。實(shí)驗(yàn)配置了10組標(biāo)準(zhǔn)樣品液，濃度分別為0.025 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.3 μg/mL、0.4 μg/mL、0.5 μg/mL、0.6 μg/mL、0.7 μg/mL、0.8 μg/mL，準(zhǔn)備10個(gè)三聚氰胺金標(biāo)卡，不同濃度三聚氰胺樣品液在金標(biāo)卡的反應(yīng)結(jié)果經(jīng)過(guò)定量系統(tǒng)掃描檢測(cè)，其檢測(cè)數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 不同標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度下St/Sc檢測(cè)數(shù)據(jù)

以3次掃描得到的St/Sc平均值作為橫坐標(biāo)，以三聚氰胺溶液濃度值作為縱坐標(biāo)，通過(guò)樣本點(diǎn)采用線性擬合的方法建立濃度定量函數(shù)曲線模型，如圖15所示，采用多項(xiàng)式擬合的方法建立濃度定量函數(shù)曲線模型，如圖16所示。

圖15 線性擬合圖

圖16 多項(xiàng)式擬合圖

濃度函數(shù)模型的建立采用線性擬合與多項(xiàng)式擬合的方法，通過(guò)比較對(duì)兩種方法所建立的函數(shù)關(guān)系式，可以看出多項(xiàng)式擬合效果優(yōu)于線性擬合效果，而在多項(xiàng)式擬合中，三次多項(xiàng)式擬合的曲線相比于其他次方多項(xiàng)式擬合曲線較平滑，且與各個(gè)樣本點(diǎn)之間的偏差最小，為最優(yōu)的曲線擬合函數(shù)模型。

2.3 流程圖

為使金標(biāo)卡定量?jī)x能夠高效穩(wěn)定的運(yùn)行，不僅需要對(duì)底層硬件進(jìn)行配置調(diào)試，還需要給系統(tǒng)提供穩(wěn)定可靠的程序做中央控制。該檢測(cè)儀器軟件開(kāi)發(fā)平臺(tái)使用的是Keil5，在搭配好硬件電路基礎(chǔ)上，通過(guò)該平臺(tái)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行開(kāi)發(fā)。首先對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行初始化設(shè)置，將滴入待測(cè)液的金標(biāo)卡置于檢測(cè)區(qū)，由于金標(biāo)卡的顯色會(huì)隨時(shí)間的變化而變化，根據(jù)金標(biāo)卡顯色檢測(cè)最佳時(shí)間，設(shè)置檢測(cè)定時(shí)，定時(shí)結(jié)束，系統(tǒng)自動(dòng)對(duì)金標(biāo)卡進(jìn)行掃描采集數(shù)據(jù)，并對(duì)采集到的數(shù)據(jù)自動(dòng)分析判斷，若檢測(cè)過(guò)程中未檢測(cè)到C線，則直接進(jìn)入結(jié)果顯示并存儲(chǔ)，本次檢測(cè)判定為無(wú)效，若檢測(cè)到C線，則對(duì)采集到的T線與C線數(shù)據(jù)進(jìn)行濃度定量計(jì)算，最后將得到的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)顯示屏顯示并存入存儲(chǔ)器，再根據(jù)用戶需求選擇打印檢測(cè)結(jié)果報(bào)告單，系統(tǒng)流程如圖17所示。

圖17 系統(tǒng)軟件流程圖

表3 不同濃度下St/Sc值與濃度值

表4 不同濃度下St/Sc值與濃度值

3 測(cè)試結(jié)果及分析

對(duì)系統(tǒng)性能進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)配置8組濃度為0.05 μg/mL、0.15 μg/mL、0.25 μg/mL、0.35 μg/mL、0.45 μg/mL、0.55 μg/mL、0.65 μg/mL、0.75 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)三聚氰胺溶液，分別滴加到三聚氰胺金標(biāo)檢測(cè)卡上，待充分反應(yīng)后，金標(biāo)卡通過(guò)系統(tǒng)掃描，每組濃度樣本檢測(cè)8次，并將檢測(cè)得到的St/Sc值與其所對(duì)應(yīng)的濃度值記錄下來(lái)，檢測(cè)的數(shù)據(jù)如表3、表4所示。

通過(guò)對(duì)以上實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，系統(tǒng)穩(wěn)定性分析如表5所示，系統(tǒng)準(zhǔn)確性分析如表6所示。分析結(jié)果顯示，該系統(tǒng)存在變異系數(shù)最大值為3.64%，最小值為1.65%，具有較高的穩(wěn)定性。絕對(duì)誤差小于0.033 μg/mL，同時(shí)具備較高的準(zhǔn)確性，系統(tǒng)對(duì)金標(biāo)卡具有良好的定量效果。

表5 系統(tǒng)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)分析

表6 系統(tǒng)準(zhǔn)確性數(shù)據(jù)分析

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)一款可調(diào)固定式金標(biāo)卡定量檢測(cè)儀，利用光電探測(cè)器采集金標(biāo)卡顯色區(qū)域模擬量的變化，經(jīng)系統(tǒng)建立的濃度關(guān)系式推導(dǎo)演算，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物定量分析。插卡口配有彈簧卡座可對(duì)多尺寸金標(biāo)卡進(jìn)行固定，可應(yīng)用于不同領(lǐng)域中不同待測(cè)物金標(biāo)卡檢測(cè)。經(jīng)驗(yàn)證，該系統(tǒng)具有較高的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。