GeneXpert MTB/RIF檢測系統在結核病診斷中的應用價值*

陳小娟，趙珍珍，向 尹，應斌武△

1.四川大學華西醫院實驗醫學科,四川成都 610041；2.樂山市人民醫院醫學檢驗科,四川樂山 614000

結核病是一種由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病，嚴重危害人類健康，是全球十大死亡原因之一，也是引起死亡人數最多的單一傳染性疾病[1]。早期診斷、及時抗結核治療對患者預后及預防MTB的傳播至關重要。傳統的實驗室檢測方法如涂片抗酸染色查找MTB、MTB培養等均存在各自的缺點。有研究報道，涂片抗酸染色顯微鏡檢查只能檢出每毫升>10 000個抗酸桿菌的標本[2]，靈敏度低；而作為金標準的MTB培養法耗時長,不能滿足臨床對結核病早期診斷和治療的需求。因此,臨床迫切需要快速、敏感、特異的MTB感染診斷方法。GeneXpert MTB/RIF檢測系統(簡稱GeneXpert MTB/RIF)利用巢式實時熒光定量PCR方法，通過檢測MTB編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因的81 bp利福平耐藥核心區間(RRDR)是否突變,進而輔助診斷MTB感染及利福平耐藥,能在2 h內完成檢測[3]。GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度高,其檢出限為131 CFU/mL,遠低于抗酸染色[4]。2010年世界衛生組織(WHO)推薦GeneXpert MTB/RIF用于肺結核的診斷[5],并在2013年推薦其用于肺外結核的診斷[6]。然而,GeneXpert MTB/RIF在結核病診斷中的應用價值在不同地區之間報道存在差異[7]。本文旨在評價我國西南地區GeneXpert MTB/RIF在結核病臨床診斷中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續收集2020年7—9月四川大學華西醫院收治的臨床高度疑似結核病的住院患者，排除人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性及臨床資料不全者，最終納入401例患者為研究對象。根據結核病復合診斷標準(CRS)，分為結核組(186例)和非結核組(215例)。所有研究對象中男242例,女159例,平均年齡(50.15±17.63)歲。MTB檢測標本來自患者的痰液117例，肺泡灌洗液173例，胸腔積液及腹水52例，腦脊液16例，贅生物(組織)13例，穿刺液19例，尿液11例，均進行抗酸染色、結核分枝桿菌脫氧核糖核酸(TB-DNA)熒光定量PCR及GeneXpert MTB/RIF 3項檢測。同時對所有患者抽取靜脈血行結核感染T細胞γ-干擾素釋放試驗(TB-IGRA)。以臨床最終診斷結果為金標準對4種檢測方法的檢出率、靈敏度、特異度等指標進行統計分析，評價GeneXpert MTB/RIF對結核病的診斷效能。本研究由四川大學華西醫院倫理委員會審核通過[審批號：2019年審(829)號]，所有研究對象均簽署知情同意書。結核組納入標準：根據我國肺結核診斷標準(WS288-2017)和結核病分類標準(WS196-2017)，具有典型的結核病臨床癥狀，且至少符合以下幾項之一：(1)MTB病原學檢測陽性；(2)病理學診斷支持結核病變；(3)影像學檢查有活動性結核病的證據；(4)兩次以上TB-IGRA陽性且抗結核治療有效。

1.2儀器與試劑 本研究使用美國Cepheid公司的GeneXpert MTB/RIF及配套試劑，德國凱杰(QIAGEN)公司的TB-DNA試劑盒，實時熒光定量PCR儀型號為ABI QuantStudio5，MTB抗酸染色使用珠海貝索生物有限公司生產的染液。

1.3方法

1.3.1MTB涂片抗酸染色 按照標準操作規范及試劑說明書進行涂片抗酸染色后于顯微鏡(油鏡)下觀察計數,每100個視野可見抗酸桿菌3條及以上為陽性。

1.3.2TB-DNA熒光定量PCR 嚴格按照說明書進行標本前處理及核酸提取后,PCR反應混合液按照每測試37.8 μL PCR反應液，0.2 μL Taq酶和0.06 μL尿嘧啶糖基化酶的比例配制，從中取38.0 μL與2.0 μL已提取的標本DNA混合，構建PCR反應體系。在實時熒光定量PCR儀中擴增，擴增程序如下：37 ℃ 3 min，93 ℃ 1 min，93 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s(40個循環)。反應體系為40.0 μL。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF 檢測 在生物安全柜內按照標準操作規范操作,在前處理管中視標本性狀將標本與標配的處理液按1∶2的比例混合(若標本較濃稠則按≥1∶3的比例混合;腦脊液或相對清亮的漿膜腔積液可不處理直接檢測),漩渦震蕩后靜置15 min，標本充分液化后取2.0～2.5 mL加入GeneXpert檢測匣，于GeneXpert MTB/RIF進行檢測,檢測時間約2 h。

1.3.4TB-IGRA檢測 按照結核感染T細胞檢測試劑盒(體外釋放酶聯免疫法)說明書,采集患者4 mL肝素抗凝血,在2 h內將患者全血標本輕柔顛倒混勻5次后取1 mL分裝到本底對照培養管(N)、測試培養管(T)、陽性對照培養管(P)培養基，迅速放入37 ℃培養箱培養(22±2)h后，將培養管于3 000～5 000 r/min離心機中離心10 min,取血漿進行ELISA檢測,計算γ-干擾素(IFN-γ)水平。結果判定:T-N≥14 pg/mL為陽性,<14 pg/mL為陰性。如果校準品400 pg/mL的平均A值<1.0或試驗結果出現劑量-反應曲線相關系數r<0.990 0,則試驗無效，需重復試驗。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行統計分析。計數資料采用例數或百分率表示，各方法檢出率的比較采用χ2檢驗，以檢出率、靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值描述各檢測方法的診斷效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MTB在不同類型標本的檢出情況 在結核組，GeneXpert MTB/RIF檢測各類標本情況如下：痰液檢出率為51.85%；肺泡灌洗液檢出率為43.59%；胸腔積液及腹水檢出率為11.11%；腦脊液檢出率為22.22%；贅生物(組織)檢出率為50.00%；穿刺液檢出率為42.86%；尿液檢出率40.00%。見表1。

2.2各檢測方法的診斷效能評估 本研究納入的401例疑似結核病患者，臨床最終診斷結果為結核病186例，非結核病215例。各方法檢測結核組和非結核組的結果見表2。在MTB的檢測技術中,GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR的檢出率分別為19.45%、6.73%、18.45%，其中3例TB-DNA熒光定量PCR陽性患者臨床最終診斷為非結核病，1例抗酸染色陽性患者最終診斷為非MTB感染。在患者全血標本TB-IGRA檢測中,檢出陽性235例，檢出率為58.60%(235/401)。以臨床最終診斷結果為金標準，GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA 4種方法診斷結核病的靈敏度分別為41.94%、13.98%、38.17%、69.35%，特異度分別為100.00%、99.53%、98.60%、50.70%，陽性預測值分別為100.00%、96.30%、95.95%、54.89%，陰性預測值分別為66.56%、57.22%、64.83%、65.66%。結果顯示：在結核組，GeneXpert MTB/RIF檢出陽性78例，靈敏度為41.94%，較抗酸染色(13.98%)明顯提高，差異有統計學意義(χ2=36.090,P<0.05)，而與TB-DNA熒光定量PCR(38.17%)相比，差異無統計學意義(χ2=0.549,P=0.459)；TB-IGRA檢出陽性129例，靈敏度為69.35%，較其他3種方法靈敏度明顯提高(χ2=118.764,P<0.05),但其在非結核組檢出陽性106例，陰性109例，特異度為50.70%，明顯低于其他3種方法(χ2=342.791,P<0.001)。

表1 結核組和非結核組的各類型標本MTB檢出情況[%(n/n)]

表2 GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA診斷結核的效能比較

續表2 GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA診斷結核的效能比較

2.3GeneXpert MTB/RIF對利福平耐藥的檢測 在78例GeneXpert MTB/RIF檢測陽性的患者中，檢出利福平耐藥共7例，其中2例為痰液標本，2例為肺泡灌洗液標本，1例為胸腔積液標本，2例為穿刺液標本，臨床據此結果對上述7例患者行表型藥敏試驗后均診斷為利福平耐藥。

3 討 論

GeneXpert MTB/RIF可同時進行MTB及利福平耐藥檢測，是集標本處理、PCR擴增于一體的全封閉自動化分子檢測平臺。近年來,基于其具有靈敏度高、特異度高、生物安全性高、檢測速度快等優點，該技術被用于肺內及肺外結核標本中MTB及利福平耐藥檢測、臨床分離的MTB菌株的檢測等,并成為WHO推薦的MTB分子檢測技術[8-9]。

本研究通過比較GeneXpert MTB/RIF與抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA檢測的靈敏度和特異度等指標,初步探討其在診斷結核感染方面的應用價值。本研究中,GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA熒光定量PCR、TB-IGRA的檢測靈敏度分別為41.94%、13.98%、38.17%、69.35%,特異度分別為100.00%、99.53%、98.60%、50.70%。結果顯示，在特異度方面GeneXpert MTB/RIF為100.00%，優于其他3種方法。抗酸染色特異度雖也較高，但其靈敏度較低，且檢測陽性者需進一步行分枝桿菌菌種鑒定，如本研究中1例抗酸染色陽性患者最終診斷為非MTB感染。靈敏度方面，GeneXpert MTB/RIF僅次于TB-IGRA，但TB-IGRA檢測基于免疫學原理，結果依賴于患者的免疫狀態，DRUSZCZYNSKA等[10]報道，既往感染MTB及長期暴露于MTB環境中均可導致TB-IGRA結果不完全可靠。本研究中TB-IGRA的特異度為50.70%，較文獻[11]報道的65.80%更低，這可能與研究對象年齡、性別、免疫狀態及病毒感染狀態有關，需進一步擴大樣本量進行研究。從檢測平臺的易用性來看，GeneXpert MTB/RIF檢測快速、簡便，對試驗條件要求低且不易污染。本研究中TB-DNA熒光定量PCR在非結核組檢出3例假陽性，可能是操作過程中的污染造成的(TB-DNA熒光定量PCR檢測手工操作煩瑣、對試驗條件要求高且容易造成交叉污染)。此外，GeneXpert MTB/RIF在利福平耐藥檢測方面，雖然本次研究病例較少，檢出耐藥患者7例，但均與表型藥敏試驗結果相符，表明其具有較好的臨床用藥指導價值。

另外,通過比較GeneXpert MTB/RIF檢測不同類型標本中的MTB檢出率,分析不同類型標本對診斷結核的影響。本研究中,GeneXpert MTB/RIF在痰液中檢出率最高(51.85%),其次是贅生物(組織)(50.00%),而其在胸腔積液及腹水中檢出率最低(11.11%),這與ALLAHYARTORKAMAN等[12]的研究結果相符。本研究中GeneXpert MTB/RIF在腦脊液中靈敏度低于DENKINGER等[13]和GARG[14]的報道,可能與腦脊液含菌量較低有關。本研究顯示,GeneXpert MTB/RIF檢測與涂片抗酸染色鏡檢、TB-DNA熒光定量PCR檢測相比,在幾種肺外結核標本如腦脊液、胸腔積液及腹水、穿刺液中均具有更高的檢出率,這也與多項同類研究結果相似[13,15]。因此,GeneXpert MTB/RIF在本研究的4種檢測方法中,對肺結核和肺外結核均具有更高的診斷效能。但由于本研究病例較少,結果存在一定局限性,接下來應擴大樣本量并將MTB培養及MTB表型藥敏試驗加入研究中。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF在結核病診斷中具有較好的應用價值，有助于臨床醫生對結核病患者進行早期、快速的診斷。