某分析儀測定TT4水平異常升高的原因分析

齊永志，于銘釗，劉 敏，樂 宇

解放軍總醫院第六醫學中心檢驗科，北京 100048

甲狀腺疾病是內分泌系統的常見疾病，近年來我國甲狀腺疾病發病率明顯升高[1-2]。中華醫學會內分泌學分會撰寫的《中國甲狀腺疾病診治指南》中對甲狀腺功能實驗室檢查指標進行了探討，認為血清總甲狀腺素(TT4)、總三碘甲腺原氨酸(TT3)是反映甲狀腺功能狀態的最佳指標，其中TT4在甲狀腺功能減退的診斷中起關鍵作用[3]。筆者在臨床工作中發現少數標本TT4檢測結果升高，與甲狀腺功能其他指標結果相矛盾，給臨床診斷和治療帶來困難。本研究對TT4結果異常標本在不同的免疫分析儀上進行了比較，初步分析了干擾貝克曼DXI800全自動化學發光免疫分析儀(簡稱DXI800分析儀)檢測TT4的相關因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年8月至2019年3月解放軍總醫院第六醫學中心門診及住院進行甲狀腺功能檢測的患者150例。選取TT4、TT3、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平均正常的患者50例為TT4正常組。其中男13例，女37例；年齡25～91歲，平均(44.2±11.8)歲。選取DXI800分析儀檢測TT4水平升高、TSH水平降低的患者50例為TT4正常升高組。其中男13例，女37例；年齡25～91歲，平均(49.0±13.4)歲。選取DXI800分析儀檢測TT4水平升高，TT3、FT3、FT4、TSH水平正常的患者50例為TT4異常升高組。其中男9例，女41例，年齡25～91歲；平均(50.6±18.5)歲。

1.2儀器與試劑 DXI800分析儀及相應配套TT4檢測試劑盒、AU5821全自動生化分析儀(簡稱AU5821分析儀)及相應配套類風濕因子(RF)檢測試劑盒均購自美國貝克曼庫爾特公司；ARCHITECT I4000全自動化學發光免疫分析儀(簡稱I4000分析儀)及相應配套TT4試劑盒購自美國雅培公司。所用校準品均為廠家提供的相應配套校準品，免疫多項質控品(批號40340)、特種蛋白多項質控品(批號66380)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1TT4檢測 兩種化學發光免疫分析儀分別對TT4進行檢測，將廠家試劑盒說明書提供的生物參考區間作為結果判斷標準，超過參考區間上限為檢測結果升高。貝克曼庫爾特公司試劑盒說明書提供的TT4生物參考區間為70.0～152.0 nmol/L；雅培公司試劑盒說明書提供的TT4生物參考區間為62.8～151.2 nmol/L。

1.3.2RF檢測 在AU5821分析儀上測定3組的RF水平，操作人員熟練掌握檢測方法，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行，檢測方法為免疫透射比濁法，超過試劑盒說明書提供的生物參考區間上限(14 IU/mL)為RF檢測結果升高，檢測線性為10～120 IU/mL。

1.3.3堿性磷酸酶(ALP)檢測 選取在DXI800分析儀上TT4水平升高，I4000分析儀上TT4水平正常的16份標本為試驗組進行ALP水平測定，同時選取TT4正常組和TT4正常升高組中的標本各16份為對照1組和對照2組，也進行ALP水平測定。檢測儀器為AU5821分析儀，檢測方法為速率法，以試劑盒說明書提供的生物參考區間(30～120 U/L)為結果判斷標準，檢測線性為5～1 500 U/L。

1.3.4ALP抗體阻斷試驗 選取上述試驗組中的11份標本進行ALP抗體阻斷試驗。ALP抗體阻斷劑(sALP)購自日本Osaka biochemical plant公司，水平為5 mg/mL。進行平行試驗，分成3組：原液組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、sALP去干擾組。原液組選取300 μL標本原液，PBS組選取270 μL標本原液再加入30 μL PBS，sALP去干擾組選取270 μL標本原液再加入30 μL sALP。室溫孵育30 min，1 000 r/min離心30 s，采用DXI800分析儀對3組標本TT4水平進行檢測。

2 結 果

2.1兩種儀器對TT4正常組、TT4正常升高組標本檢測結果的比較 對兩種儀器TT4檢測數據進行McNemar檢驗，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷比較，差異無統計學意義(P=0.289)，一致性檢驗Kappa=0.84(P<0.05)，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷一致性較好。見表1。

表1 兩種儀器檢測TT4正常組、TT4正常升高組標本的結果比較(n)

2.2兩種儀器對TT4正常組、TT4異常升高組標本檢測結果的比較 對兩種儀器TT4檢測數據進行McNemar檢驗，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷差異有統計學意義(P=0.001)。見表2。

2.3各組RF檢測結果比較 TT4正常組、TT4正常升高組、TT4異常升高組的RF檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩種儀器檢測TT4正常組、TT4異常升高組標本的檢測結果比較(n)

表3 RF檢測結果在各組中比較(n)

2.4各組ALP水平比較 對照1組、對照2組、試驗組ALP水平分別為(76.7±23.6)U/L、(77.0±21.5)U/L和(78.1±27.1)U/L，經單因素方差分析，3組ALP水平比較，差異無統計學意義(F=0.014，P=0.986)。

2.5ALP抗體阻斷試驗后TT4水平比較 sALP去干擾組和PBS組TT4檢測結果比較[(166.89±32.17)nmol/Lvs. (193.51±26.03)nmol/L]，差異有統計學意義(t=-2.275，P=0.046)，PBS組和原液組TT4檢測結果比較[(193.51±26.03)nmol/Lvs. (185.46±32.70)nmol/L]，差異也有統計學意義(t=2.695，P=0.023)。其中2份標本經sALP去干擾后TT4檢測結果落入生物參考區間內。

3 討 論

臨床實驗室對TT4水平的檢測大多采用抗原抗體反應，但采用的指示系統不同：放射免疫比濁法采用的是放射性同位素標記；臨床常用的化學發光法可以用發光物質直接標記，也可采用酶類標記，稱為酶聯免疫化學發光法；而電化學發光法采用三聯吡啶釕進行標記[4]。本研究中DXI800分析儀采用ALP標記TT4，標本中TT4與試劑中的鼠源性TT4抗體競爭性結合，抗原抗體復合物可與包被磁微粒的捕獲抗體(羊抗鼠抗體)結合，產生的光量子值與標本內的TT4水平呈反比，以此測定TT4水平。I4000分析儀采用吖啶酯進行標記，吖啶酯標記的TT4與標本中的TT4競爭結合試劑中的羊抗人TT4抗體，檢測抗體直接包被的磁微粒，以此測定TT4水平。兩種儀器標記物的不同，以及DXI800分析儀捕獲抗體的加入，均可能導致兩種儀器抗干擾能力及檢測結果的差異。

本研究依據DXI800分析儀的檢測結果篩選出可能受干擾的標本，進一步試驗確定干擾因素，試驗目的并不是比較兩種檢測儀器抗干擾能力的差異，試驗結果也不能說明兩種儀器整體抗干擾能力的優劣。現階段TT4免疫定量分析缺乏統一溯源，不同檢測儀器檢測結果在數值上不具有可比性，在國家衛生健康委員會組織的室間質量評價中，TT4化學發光定量檢測也是按儀器進行分組，這是本研究中沒有應用配對樣本t檢驗對不同檢測儀器數據進行處理的原因。不同檢測儀器通過相應的生物參考區間進行判讀，結果應該基本一致，TT4正常組和TT4正常升高組的數據分析也表明兩種檢測儀器一致性較好，Kappa值為0.84。50例DXI800分析儀檢測TT4水平升高標本中，有16例在I4000分析儀上檢測正常，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷結果差異較大，說明兩種檢測儀器的抗干擾能力可能不同。

RF對抗原抗體反應產生干擾的報道較多，對酶聯免疫吸附法和化學發光法均可產生干擾，主要原理是RF可以與檢測抗體(動物來源)的Fc段結合，干擾抗體與檢測物的結合[5-6]。本研究中RF水平檢測采用免疫透射比濁法，檢測線性為10～120 IU/mL，當檢測結果<10 IU/mL時超出了檢測線性范圍，而RF生物參考區間為0～14 IU/mL，在RF檢測結果正常的標本中，大部分結果<10 IU/mL，所以數據按照計數資料進行分析。本研究對TT4正常組、TT4正常升高組、TT4異常升高組進行RF水平檢測，差異無統計學意義(P>0.05)，說明RF不是TT4結果異常升高的主要原因。

從檢測原理分析，DXI800分析儀標記物是ALP，如果標本ALP水平過高，可能干擾試驗，但對I4000分析儀不產生干擾。當DXI800分析儀檢測方法為雙抗體夾心法時，檢測信號值與檢測物水平呈正比，標本中的ALP可造成檢測信號升高，使檢測結果出現假陽性。多項研究表明，內源性ALP可造成肌鈣蛋白I、人絨毛膜促性腺激素假陽性[7-9]。當DXI800分析儀TT4檢測采用免疫競爭法時，檢測信號值與檢測物水平呈反比，如果標本中存在高水平的ALP會造成TT4檢測結果降低，而不是比真實水平升高，在DXI800分析儀采用免疫競爭法檢測睪酮的研究中發現，患者服用合成的ALP治療后會造成睪酮檢測值降低[10]。本研究中對照1組、對照2組、試驗組ALP水平檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明TT4異常升高組標本中ALP水平沒有明顯升高，在本研究中ALP不是造成TT4檢測結果異常升高的原因。

有研究表明，人體內存在ALP抗體會造成雌二醇檢測結果偏高，加入sALP后，檢測結果明顯降低[11]。該研究也在被測標本中加入不同水平的ALP抗體，證明ALP抗體的存在對DXI800分析儀造成干擾，但不同水平、不同種類的ALP抗體可能會使雌二醇檢測結果偏高或偏低[11]。對于免疫競爭法檢測TT4，一方面ALP抗體可結合到T4-ALP復合物上，影響酶結合物催化底物發光，另一方面ALP抗體與T4-ALP結合后，可能阻止T4-ALP復合物與抗T4抗體的結合。兩種機制均可造成信號值降低，最終使TT4檢測結果異常升高。sALP中含有滅活的ALP，可與標本中的ALP抗體結合，消除干擾。本研究中采用sALP去干擾后，TT4水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，同時兩份標本經sALP去干擾后結果變為正常，說明ALP抗體的存在對部分標本TT4的檢測有干擾，可能影響到臨床的診斷和治療。

此外，若患者體內存在人抗鼠抗體，可以和捕獲抗體(羊抗鼠抗體)競爭結合鼠源性檢測抗體，可導致抗原抗體復合物不能被捕獲抗體捕獲，光量子值降低，最終TT4檢測值升高。含有鼠免疫球蛋白的阻斷劑可以特異性地去除人抗鼠抗體的干擾，但考慮到多余的阻斷劑可與捕獲抗體結合，難以去除，所以本研究并未進行異嗜性抗體阻斷試驗，后續研究可進一步對標本中人抗鼠抗體進行直接檢測，以證明異嗜性抗體干擾的存在。

綜上所述，標本中ALP抗體的存在可能是DXI800分析儀檢測TT4水平異常升高的原因之一，采用不同檢測儀器復查，同時結合患者臨床癥狀分析，可有效減少不同干擾因素引起的異常結果。