無創(chuàng)產(chǎn)前篩查中胎兒游離DNA比例的影響因素分析*

王 杰，冀小平,武麗瓊，安 槿，侯東霞，朱 博，郭志遠(yuǎn)，張美玲，王 艷，王曉華△

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院遺傳優(yōu)生科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021

血液中的游離DNA主要是指存在于外周血中的游離于細(xì)胞外的DNA片段，主要通過活細(xì)胞的主動(dòng)釋放或凋亡、死亡細(xì)胞的被動(dòng)釋放而產(chǎn)生，經(jīng)快速降解后釋放到血循環(huán)中[1]。1997年，LO等[2]發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中的游離DNA除了來源于孕婦自身外，還有極少部分是來自于胎兒，其中來源于孕婦的游離DNA占80%～95%，來源于胎兒游離DNA(cffDNA)占5%～20%。孕婦外周血中的cffDNA主要來源于穿過胎盤屏障的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞。因此，理論上當(dāng)胎兒為三體時(shí)，孕婦外周血中的cffDNA也同樣為三體，這使得該染色體上孕婦外周血cffDNA比例與健康孕婦相比，明顯升高。這一發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPS)技術(shù)打下了理論基礎(chǔ)。

由于cffDNA在孕婦外周血中占比極低，因此NIPS檢測的可靠性在很大程度上取決于所測試樣品中是否有足夠的cffDNA。一般來說，孕婦外周血cffDNA比例通常在3%～30%[3]。通常情況下，胎兒非整倍體的產(chǎn)前篩查要求cffDNA比例至少達(dá)4%[3]。如果孕婦外周血中的cffDNA比例過低，則可能受相對(duì)比例較高的孕婦正常DNA的影響，進(jìn)而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至造成檢測失敗。這不僅給孕婦造成了困擾，也影響了該技術(shù)在臨床中的推廣、應(yīng)用。有研究提示，cffDNA比例與孕周呈正相關(guān)，與孕婦體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)呈負(fù)相關(guān)，妊娠期并發(fā)癥或合并癥、孕婦年齡、孕中期唐氏篩查結(jié)果、胎兒染色體核型及頸后透明層也是潛在的影響因素[4]。本研究對(duì)在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院進(jìn)行NIPS檢測的4 268例孕婦外周血cffDNA比例與孕周、孕婦BMI、孕婦年齡、妊娠單雙胎、標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)間等相關(guān)因素之間的關(guān)系進(jìn)行了回顧性分析，對(duì)所有篩查對(duì)象跟蹤隨訪至胎兒出生，以探討影響cffDNA比例的因素，分析NIPS失敗的原因，為不同孕婦制訂個(gè)體化的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測方案提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年9月至2019年3月于內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院進(jìn)行NIPS檢測的4 268例孕婦，孕周為11+3～36周，其中孕早期(11～12周)157例，孕中期(>12～27周)4 091例，孕晚期(>27～36周)20例；單胎4 158例(97.42%)，雙胎110例(2.58%)；孕婦年齡18～47歲，平均(31±6)歲；BMI為15.62～35.71 kg/m2,中位BMI為23.44 kg/m2。所有研究對(duì)象根據(jù)孕周、BMI、年齡、妊娠單雙胎、標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)間分成不同的組別。檢測孕周不在最適檢測孕周(12+0～22+6周)的孕婦，其中<12+0周6例，>22+6周149例。由臨床醫(yī)生告知研究對(duì)象本研究的目的、方法等，研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1NIPS檢測方法 抽取孕婦外周靜脈血5 mL，置于cffDNA專用真空采血管(康為世紀(jì)，中國)中，分別以1 600×g及16 000×g低溫離心10 min后得到血漿標(biāo)本。應(yīng)用聯(lián)合探針錨定聚合測序法，按照胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒說明書操作，并借助于BGI500測序平臺(tái)進(jìn)行測序，利用高分辨率成像系統(tǒng)及生物信息系統(tǒng)轉(zhuǎn)換得到待測序列。所得序列經(jīng)與人參考基因組(GRCh37/hg19)比對(duì)，確定每一測序reads染色體的定位，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)化Z值。當(dāng)標(biāo)本滿足度量標(biāo)準(zhǔn)(有效數(shù)據(jù)量≥3.5 Mb，無擴(kuò)增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化Z值評(píng)估檢測結(jié)果：若Z值的絕對(duì)值≥3，提示高風(fēng)險(xiǎn)；若Z值為>-3～<3，結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2cffDNA比例的評(píng)估方法 (1)Y染色體估算法[3]：健康女性的染色體核型為46，XX，是不含Y染色體的，也就是說一旦在孕婦血漿中檢測出了來源于Y染色體的cffDNA片段，則為cffDNA。(2)SeqFF估算法[5]：在孕婦血漿中檢測到的cffDNA并非是均勻、散在分布在染色體所有區(qū)域的。實(shí)際上，在有的染色體區(qū)域內(nèi)，cffDNA占比高，而在有的染色體區(qū)域內(nèi)，cffDNA占比很少。利用cffDNA這一特性，將各常染色體按照每50 kb分割成區(qū)間窗口(bin)，選出cffDNA片段為100～150 bp的bin，計(jì)算這些cffDNA片段長度較短的bin占所有bin的比例，并以GC含量、讀段數(shù)等指標(biāo)作為參數(shù)，建立一個(gè)高度回歸模型，即seqFF模型，通過該模型即可估算cffDNA比例。本研究將Y染色體估算法和seqFF估算法綜合運(yùn)用，評(píng)估標(biāo)本中cffDNA比例。選擇3.5%作為cffDNA比例最低檢測限[6]。

1.2.3妊娠結(jié)局隨訪 查詢電子病歷記錄系統(tǒng)或打電話對(duì)孕婦的妊娠結(jié)局進(jìn)行追蹤隨訪。隨訪內(nèi)容包括胎兒或新生兒是否表現(xiàn)為典型的21、18、13-三體綜合征，孕婦有無流產(chǎn)、引產(chǎn)、雙胎之一消失，分娩孕周，以及新生兒出生時(shí)健康狀況、體格檢查結(jié)果、有無其他臨床診斷和(或)遺傳學(xué)診斷的異常。

2 結(jié) 果

2.1孕婦血漿cffDNA比例與孕周的相關(guān)性分析 4 268例孕婦cffDNA比例為1.025%～29.851%，中位cffDNA比例為7.392%，其中孕19+5周最低，孕30+1周最高。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，cffDNA比例與孕周呈正相關(guān)(r=0.113，P<0.05)。但cffDNA比例隨孕周增長的速度不一致，孕11～22周，cffDNA比例每周約增加0.2%，孕22周以后，每周約增加0.7%。見圖1。

在75例cffDNA比例<3.5%的孕婦中，孕15周cffDNA比例<3.5%的孕婦比例最低，為0.41%(2/493)，孕19周cffDNA比例<3.5%的孕婦比例最高，為3.36%(11/327)。cffDNA比例<3.5%的孕婦的孕周比較，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

注：曲線為spline擬合曲線。

圖1 cffDNA比例與孕周的相關(guān)性 表1 cffDNA比例<3.5%的孕婦在不同孕周的分布[n(%)]

2.2孕婦血漿cffDNA比例與BMI的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，cffDNA比例與BMI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.261，P<0.05)。依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的BMI界限值，將孕婦按照BMI分為4組：低體質(zhì)量組(BMI<18.50 kg/m2)、正常體質(zhì)量組(BMI為18.50～<25.00 kg/m2)、超重組(BMI為25.00～<30.00 kg/m2)和肥胖組(BMI≥30.00 kg/m2)。低體質(zhì)量組、正常體質(zhì)量組、超重組和肥胖組平均cffDNA比例分別為9.26%、8.29%、7.26%、6.29%，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著BMI的升高，cffDNA比例明顯降低。見圖2。

注：曲線為spline擬合曲線。

2.3孕婦血漿cffDNA比例與孕婦年齡的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，cffDNA比例與孕婦年齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.088，P<0.05)。根據(jù)孕婦年齡，將孕婦分為高齡組(≥35歲)和低齡組(<35歲)，高齡組、低齡組平均cffDNA比例分別為7.57%、8.11%，經(jīng)單因素分析后得出兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著年齡的升高，cffDNA比例明顯降低。見圖3。

注：曲線為spline擬合曲線。

2.4孕婦血漿cffDNA比例與妊娠單雙胎的相關(guān)性分析 單胎組、雙胎組平均cffDNA比例分別為7.92%、8.47%。經(jīng)單因素分析后得出兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析，妊娠單雙胎與cffDNA比例無相關(guān)性(r=0.025,P>0.05)。

2.5孕婦血漿cffDNA比例與標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)間的相關(guān)性分析 使用cffDNA專用采血管采集全血，按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)輸，放置于6～35 ℃環(huán)境中，96 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室并處理。將運(yùn)輸時(shí)間分為4組：<24 h組、24～<48 h組、48～<72 h、72～<96 h組。各組平均cffDNA比例分別為7.92%、7.83%、8.05%、8.14%。經(jīng)單因素分析后得出4組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析，標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)間與cffDNA比例無相關(guān)性(r=0.021，P>0.05)。見圖4。

圖4 cffDNA比例與運(yùn)輸時(shí)間的相關(guān)性

2.6cffDNA比例<3.5%的標(biāo)本重新采血后的檢測結(jié)果 對(duì)16例cffDNA比例<3.5%的標(biāo)本(孕12+5～19+4周)進(jìn)行了重新取樣檢測，中位間隔時(shí)間為17.1 d。其中8例標(biāo)本經(jīng)重新取樣檢測后cffDNA比例>3.5%，中位間隔時(shí)間17.3 d；另有8例標(biāo)本經(jīng)重新取樣檢測后cffDNA比例依舊<3.5%，中位取樣間隔時(shí)間16.9 d，這8例孕婦超重3例，肥胖2例。經(jīng)隨訪，妊娠結(jié)局均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

3 討 論

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的成熟及測序成本的不斷降低，基于孕婦外周血cffDNA的NIPS技術(shù)越來越多地被應(yīng)用于胎兒染色體數(shù)目異常相關(guān)疾病的檢測。NIPS技術(shù)要有效地檢測出胎兒染色體數(shù)目異常，cffDNA比例十分重要[7]。

研究表明，cffDNA比例受孕婦和胎兒兩方面因素的影響，孕婦因素包括孕周、體質(zhì)量、妊娠期并發(fā)癥或合并癥、年齡、孕中期唐氏綜合征血清學(xué)篩查的危險(xiǎn)系數(shù)、血清妊娠相關(guān)蛋白A和游離β-人絨毛膜促性腺激素的變化[8]。其中cffDNA比例與孕周呈正相關(guān)，與孕婦BMI呈負(fù)相關(guān)。胎兒因素包括胎兒的單胎或多胎、胎兒染色體核型及胎兒頸后透明層厚度等，這些也是潛在的影響因素[4,7,9]。此外，標(biāo)本運(yùn)輸時(shí)間或?qū)嶒?yàn)室提取方法的差異也會(huì)對(duì)cffDNA比例產(chǎn)生一定影響。

3.1孕婦自身因素對(duì)cffDNA比例的影響 在本研究中cffDNA比例與孕婦采血時(shí)的孕周呈正相關(guān)。隨著孕周的增加，胎盤體積逐漸增大，凋亡的滋養(yǎng)層細(xì)胞增多，因此釋放到孕婦血液中的DNA片段增加。但是本研究發(fā)現(xiàn)，cffDNA比例在不同孕周增長速度不一致，孕11～22周，cffDNA比例每周約增加0.2%，22周以后，每周約增加0.7%，這與之前報(bào)道的在孕10～21周,cffDNA每周約增加0.1%，21周后,每周約增加1.0%類似[10]。在孕19周時(shí)，cffDNA比例<3.5%的比例相對(duì)較高，較少見相關(guān)的報(bào)道。

本研究還發(fā)現(xiàn)cffDNA比例與孕婦BMI之間存在負(fù)相關(guān)性，與之前的研究結(jié)果一致[11]。可能的原因是受到孕婦血液中總體游離DNA水平的影響，隨著孕婦體質(zhì)量的增加，血容量增加，導(dǎo)致血液中的總體游離DNA水平升高，從而稀釋了外周血中的cffDNA，使cffDNA比例降低。另一方面，由于肥胖孕婦具有的更多的脂肪組織，可通過脂肪細(xì)胞壞死或基底層的血管組織凋亡進(jìn)行活躍的脂肪重建。脂肪細(xì)胞裂解后，cffDNA釋放入血，從而導(dǎo)致血中來源于孕婦的DNA含量更高，而cffDNA含量不變,因此導(dǎo)致cffDNA比例更低[12]。針對(duì)高BMI對(duì)cffDNA比例的影響，2016年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)指南指出，肥胖孕婦外周血中的cffDNA比例通常較低，建議肥胖孕婦直接使用傳統(tǒng)篩查方法，而不采用NIPS。我國的相關(guān)技術(shù)規(guī)范也將肥胖孕婦列入NIPS慎用人群。與年齡的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，cffDNA比例與孕婦年齡呈負(fù)相關(guān)，與HOU等[11]的研究結(jié)果相符。

3.2妊娠單雙胎及運(yùn)輸時(shí)間對(duì)cffDNA比例的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，適宜孕周內(nèi)的妊娠單雙胎以及按照采血管要求的運(yùn)輸條件下的運(yùn)輸時(shí)間與cffDNA比例無相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于地廣人稀，東西、南北跨度均較大的內(nèi)蒙古地區(qū)至關(guān)重要，在合適的運(yùn)輸條件下96 h內(nèi)cffDNA比例沒有明顯差異，有助于偏遠(yuǎn)地區(qū)標(biāo)本的收集及檢測，為NIPS在欠發(fā)達(dá)地區(qū)的普及提供可能。

3.3cffDNA比例<3.5%的標(biāo)本2次采樣的可行性評(píng)估 對(duì)首次檢查發(fā)現(xiàn)cffDNA比例低的孕婦建議重新采血進(jìn)行第二次檢測，有50%的孕婦經(jīng)第2次檢測后會(huì)得到結(jié)果，這與之前的研究結(jié)果一致[13-14]。二次采血后cffDNA仍偏低的標(biāo)本中BMI≥25.00 kg/m2的占65.5%(5/8)，推測在最適的檢測孕周，BMI是影響cffDNA比例的主要因素。另有3例BMI在正常范圍的孕婦cffDNA比例仍<3.5%，可能是受其他因素的影響。目前對(duì)于重新采血時(shí)機(jī)的選擇及再次行NIPS獲得結(jié)果的可能性尚未達(dá)成共識(shí)，因?yàn)橹匦虏裳獣r(shí)，隨著孕周的增加，孕婦體質(zhì)量和BMI也會(huì)增加。美國醫(yī)學(xué)遺傳與基因組學(xué)學(xué)會(huì)在2016年發(fā)布的關(guān)于NIPS在胎兒染色體非整倍體疾病篩查的應(yīng)用指南中建議：如果孕婦是在合適的檢測孕周出現(xiàn)了cffDNA比例低導(dǎo)致NIPS失敗，可建議孕婦直接進(jìn)行產(chǎn)前診斷，而不是重新采血再次進(jìn)行NIPS檢測[15]。我國目前多采用先重新采血檢測，而不直接進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，對(duì)于第2次NIPS失敗的孕婦，建議接受進(jìn)一步的遺傳咨詢、全面的超聲評(píng)估和產(chǎn)前診斷[16]。

綜上所述，孕周越小、BMI越大、年齡越大，cffDNA比例越低，NIPS的失敗率越高。因此，臨床需要告知孕婦相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，可根據(jù)篩查對(duì)象的BMI、年齡、孕周制訂個(gè)體化的采血時(shí)間，對(duì)于肥胖、年齡較大的孕婦可適當(dāng)將篩查孕周后移。對(duì)首次采血cffDNA比例未達(dá)標(biāo)的標(biāo)本，可以先進(jìn)行重新采血檢測，對(duì)于第2次NIPS失敗的孕婦，建議接受進(jìn)一步的遺傳咨詢、全面的超聲評(píng)估和產(chǎn)前診斷，并對(duì)胎兒結(jié)局進(jìn)行隨訪。仍有一部分cffDNA比例低導(dǎo)致NIPS失敗的孕婦，具體原因不明，后續(xù)關(guān)于胎兒染色體核型、孕期并發(fā)癥/合并癥、重新采血時(shí)機(jī)和其他影響cffDNA比例因素的研究需要進(jìn)一步完善。同時(shí)，也需要不斷研究新的cffDNA富集方法，提高cffDNA比例，不斷提高NIPS的檢出率。