某院ST11型耐碳青霉烯酶高毒力肺炎克雷伯菌分子流行病學研究*

程瑞飛，侯思南，張春嬌，劉兆飛，姜亞鋒

1.南京中醫藥大學連云港附屬醫院/江蘇省連云港市中醫院檢驗科，江蘇連云港 222000；2．江蘇省連云港市婦幼保健院醫學遺傳與產前診斷科，江蘇連云港 222000

肺炎克雷伯菌是一種可對人產生較強致病性的條件致病菌，可通過多種途徑感染人體。根據致病性和毒力，可將肺炎克雷伯菌分為2種：與多重耐藥相關的經典型肺炎克雷伯菌(cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(HVKP)。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的大量應用，cKP大量地轉變為耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(CRKP)。CRKP的ST分型主要包括在亞洲尤其是中國流行的ST11型，以及在歐洲及北美地區流行的ST258型。HVKP的毒力顯著高于cKP，可引起嚴重的社區獲得性感染，常引起化膿性肝膿腫、嚴重肺炎、腦膜炎和壞死性筋膜炎等。HVKP引起的疾病通常是因其過度分泌莢膜多糖所致[1-2]，感染對象主要為健康的年輕人群，主要ST分型包括ST23、ST65及ST86型等[3]。該菌對除了氨芐西林外的其他大部分抗菌藥物均敏感。有研究報道了我國東南地區某醫院攜帶blaKPC-2的耐碳青霉烯酶高毒力肺炎克雷伯菌(CR-HVKP)以ST11型克隆傳播為主[4]。隨著抗菌藥物耐藥性的加重，CR-HVKP分離株的報道越來越多[5]。鑒于ST11型CR-HVKP日趨嚴峻的形勢，本文分析了連云港市中醫院(以下簡稱該院)ST11型CR-HVKP的流行特點、耐藥基因、毒力基因及毒力表型情況，并進行同源性分析，為耐藥菌的監測和院內感染防控工作提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集該院2017年1月至2019年6月臨床分離的26株經過Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀鑒定的CRKP菌株，剔除同一患者重復分離的菌株，所有菌株實驗前經質譜儀鑒定。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀、veriti 96孔PCR擴增儀(美國ABI公司)、2720型PCR擴增儀(美國ABI公司)、凝膠成像系統分析儀(美國BIO-RAD)、CHEF Mapper脈沖場電泳儀(美國BIO-RAD)、冷凝泵(美國BIO-RAD)、電泳儀(美國BIO-RAD)、質譜儀(德國Bruker)、水浴搖床、高速低溫離心機、培養箱、水浴箱、微量加樣槍、電子天平、超純水機(摩爾)。

1.2.2試劑 美羅培南(MEM)藥敏平板(自制)、MH瓊脂平板、DNA標志物、PCR擴增試劑(Mix、Taq酶、dNTP Mix、Taq Buffer等)、引物(上海生工)、滅菌去離子水、瓊脂糖凝膠(英國OXOID)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB,英國OXOID)、限制性內切酶XbaⅠ(BioLabs)、蛋白酶K、凝膠染色試劑Gelred(Biotium)等。

1.3方法

1.3.1碳青霉烯酶耐藥表型檢測 通過改良碳青霉烯酶滅活試驗(mCIM)進行碳青霉烯酶耐藥表型檢測：用1.0 μL接種環取滿環的過夜培養的純實驗菌株于2.0 mL TSB肉湯中混勻。每管放入1張含10.0 μg MEM的無菌紙片，于35 ℃培養箱孵育4 h。用10.0 μL接種環將MEM紙片從TSB肉湯中取出，輕輕擠去紙片上水分，將紙片貼在已涂布大腸埃希菌ATCC25922的MH平板上。倒置平板，35 ℃培養箱孵育18～24 h后量取抑菌圈直徑。結果判斷：抑菌圈直徑為6～15 mm,或直徑為16～18 mm的抑菌圈內有針尖狀菌落時為陽性;抑菌圈直徑為16～18 mm,或≥19 mm的抑菌圈內有針尖狀菌落時為不確定；抑菌圈直徑≥19 mm為陰性。同時進行EDTA-改良碳青霉烯酶滅活試驗(eCIM)：取已標識好的第2支含2.0 mL TSB的肉湯管，加入20.0 μL 0.5 mmol/L EDTA溶液，余下操作同mCIM。兩種試驗同時進行，將mCIM和eCIM試管中的MEM貼于同一個已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MH平板。結果判斷：當菌株mCIM陽性時，mCIM和eCIM中MEM抑菌圈直徑相差≥5 mm，eCIM結果為陽性；直徑差≤4 mm，eCIM結果為陰性。

1.3.2碳青霉烯酶耐藥基因檢測 采用Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀進行菌株鑒定及藥敏試驗。采用單重PCR檢測blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48等常見的碳青霉烯酶耐藥基因，對擴增產物進行凝膠成像，觀察有無目的條帶。

1.3.3ST分型 采用多重PCR檢測Khe、Kphp、pilv、pill、ST23、ST65、ST86等常見ST分型，并采用凝膠成像儀對PCR擴增產物進行顯影成像。Khe是肺炎克雷伯菌體外溶血酵素基因，是鑒定肺炎克雷伯菌的金標準，可作為一種PCR質控方法用于評價DNA模板的種類和質量。根據文獻[6]判斷結果，含Khe基因、kphp基因、pill基因這3條目的基因條帶為ST11型，含Khe基因、kphp基因、pill基因、Pilv基因這4條目的基因條帶為ST258型。

1.3.4黏液表型檢測 采用拉絲實驗，用接種環接觸培養基上的單個菌落，然后輕輕向上牽拉，觀察有無黏液絲。如果有，且長度≥5 mm，實驗結果即為陽性，判斷該菌株的黏液表型為高黏液性菌株。

1.3.5莢膜血清型及毒力基因檢測 采用多重PCR檢測實驗菌株最強毒力的血清型wzyK1、wzyK2,以及K位點wzyKL47、wzyKL64兩個基因。采用另一多重PCR反應體系檢測實驗菌株pLVPK毒力質粒相關的rmpA、rmpA2、iroN、intA這4個毒力基因，分別對擴增產物進行凝膠成像并觀察有無目的片段。

1.3.6毒力表型實驗 取含有毒力基因的8株對數期實驗菌株分別用生理鹽水配制成104、105、106、107CFU/mL的懸液，分別用漢密爾頓注射器經大蠟螟后足注射10.0 μL懸液進行毒力表型實驗。將注射后的蟲體分別置于無菌平皿中72 h，每12小時記錄1次大蠟螟是否死亡。同時用肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC700603進行對照實驗。若蟲體僵硬、發黑、無活動度，則判斷大蠟螟死亡。該實驗重復3次，取3次實驗的平均值。

1.3.7同源性分析 對含有毒力基因的8株實驗菌株采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)進行同源性分析：制備1%的低熔點膠，取200.0 μL細胞懸液緩沖液(CSB)，加入20.0 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，56 ℃水浴箱放置3～5 min，取出后迅速加入已制備好的1%低熔點膠200.0 μL并迅速混勻，將其迅速加入模具中包埋細菌，記錄模具每一孔對應的標本編號。加入一定的蛋白酶K和細胞裂解液(CLB)，置于54 ℃水浴搖床，孵育2 h進行細菌裂解。分別使用50 ℃的ddH2O和TE溶液清洗膠塊。將膠塊用XbaⅠ進行酶切8～12 h；配制1%PFGE凝膠并加樣待膠塊固定。在脈沖場電泳18～19 h后，洗膠脫色后用凝膠成像儀成像并保存圖片。用GelJ軟件對結果圖片進行同源性分析。判斷標準：不同菌株之間PFGE帶型相似度≥85%即為同一克隆；帶型相似度≥70%即為同一群[7]。

1.4統計學處理 收集所有菌株的標本信息及實驗結果，并采用SPSS17.0統計軟件對實驗結果進行統計，同源性分析采用GelJ軟件進行分析，大蠟螟感染模型死亡率采用Excel2016進行統計。

2 結 果

2.1碳青霉烯酶耐藥表型結果 檢測出24株實驗菌株mCIM為陽性，可以判斷為產生碳青霉烯酶，其中3株eCIM陽性。

2.2藥敏試驗及耐藥基因檢測結果 所有實驗菌株均表現為高水平耐藥、多重耐藥，具有耐碳青霉烯類抗菌藥物的特點。單重PCR結果顯示，blaKPC占73.1%(19/26)，blaNDM占7.7%(2/26)，blaIMP占3.8%(1/26)，而blaVIM、blaOXA-48未檢出，另有4株為陰性結果，可能不含碳青霉烯酶耐藥基因或含有其他不常見的碳青霉烯酶耐藥基因。22株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因的陽性菌株檢測結果與相對應菌株mCIM結果一致。

2.3ST分型 所有實驗菌株均檢出肺炎克雷伯菌的標記基因Khe，其ST分型以ST11型為主，占73.1%(19/26)，其次為ST65型，占15.4%(4/26)。ST23、ST86、ST258型未檢出。見圖1。

注：M為標志物；-為陰性對照；數字為菌株編號。

2.4黏液表型結果 1288號菌株和1334號菌株肉眼可見明顯黏液，拉絲實驗陽性，陽性率為7.69%。其他菌株拉絲實驗陰性。

2.5莢膜血清型及毒力基因檢測結果 615、1967號菌株莢膜血清型為wzyK1的占7.7%(2/26)，wzyK2未檢出。19株ST11型菌株中wzyKL47陽性率為15.8%(3/19)，wzyKL64陽性率為84.2%(16/19)。4種毒力基因rmpA、rmpA2、iroN和iutA陽性率分別為30.8%(8/26)、30.8%(8/26)、7.7%(2/26)、38.5%(10/26)，iutA陽性率較高(圖2)。其中994號及1967號菌株攜帶iutA這一種毒力基因，其ST分型分別為ST11、ST65型。至少攜帶1種毒力基因的菌株共10株，其中8株為ST11型，由康復科患者分離出的菌株占87.5%(7/8)，其中有87.5%(7/8)莢膜合成位點分型為KL64。

2.6毒力實驗結果 3次實驗中，大蠟螟在注射菌懸液水平為104、105CFU/mL時，72 h死亡率分別為37.5%、62.5%，注射水平為106、107CFU/mL時，24 h死亡率均為100.0%；而3次實驗中肺炎克雷伯菌標準菌株(對照組)72 h均未死亡，見圖3。大蠟螟感染模型結果顯示，8株攜帶毒力基因的實驗菌株均具有高毒力表型，可判斷為CR-HVKP。

8株CR-HVKP菌株均為ST11型，所有攜帶毒力基因的菌株均攜帶blaKPC基因，其莢膜血清型為非K1、K2的其他分型，2株拉絲實驗陽性。菌株的科室分布以康復科為主，痰液標本和尿液標本各占50%，感染患者的平均年齡為(64.5±19.4)歲，男女各占50%。見表1。

表1 高毒力的ST11型CR-HVKP菌株臨床信息統計

注：M為標志物；-為陰性對照；+為陽性對照；數字為菌株編號。

圖3 大蠟螟感染模型死亡情況

2.7同源性分析結果 通過GelJ軟件對PFGE結果進行分析，8株CR-HVKP可分為3群，其中1737號和1819號菌株帶型相似度高于85%，可能存在同一克隆株的散在傳播。見圖4。

圖4 8株CR-HVKP菌株的同源性分析

3 討 論

CRKP主要的耐藥機制是產碳青霉烯酶[8]，mCIM是美國臨床實驗室標準化協會于2017年推薦的一種具有較高靈敏度和特異度的檢測碳青霉烯酶表型的新方法[9-10]。eCIM與mCIM聯合使用可以區分產金屬酶和絲氨酸碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。mCIM可以單獨進行實驗，但eCIM必須同時和mCIM聯合進行實驗。本次實驗中檢測出mCIM陽性的菌株有24例，其中有22株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因，以blaKPC為主，另外2株可能攜帶其他的碳青霉烯酶耐藥基因。

1986年一種可形成長度>5 mm黏液絲并導致社區獲得性肝膿腫的肺炎克雷伯菌被報道出來。這種具有高黏液的肺炎克雷伯菌被認為是HVKP[11],是一種具有高侵襲性、可引起獲得性肝膿腫的肺炎克雷伯菌[1]，其引起肝膿腫的主要莢膜血清型為K1、K2。拉絲實驗被認為是鑒定HVKP的標準方法。目前對于HVKP的定義，仍未達成共識。肺炎克雷伯菌的高黏液表型與高毒力表型存在較大的重疊，但近年來已發現有些菌株拉絲實驗陰性卻引起健康人群侵襲性感染[12]；一項研究也發現了具有高黏液表型卻無毒力表達的克雷伯菌株[13]。最近的研究發現，pLVPK毒力質粒所攜帶的毒力相關基因rmpA、rmpA2、iutA、iucABCD和iroBCDN是導致高毒力表型的主要原因[14-15]。本文結合分子生物學篩選出攜帶毒力基因的菌株，通過大蠟螟感染模型證實其具有高毒力表型，將攜帶相關毒力基因、具有毒力表型的肺炎克雷伯菌定義為HVKP。HVKP的毒力與莢膜多糖(K抗原)、脂多糖(O抗原)、鐵載體系統、菌毛(如1型和3型菌毛)、非菌毛黏附蛋白及其他的毒力基因有關[16-17]。

有研究認為肺炎克雷伯菌的高耐藥性與高毒力性不會重疊出現[18]，然而近年來CR-HVKP菌株在世界范圍內，特別是在我國被越來越多地檢出[19-20]。CR-HVKP是由于經典的CRKP獲得了pLVPK毒力質粒[4]或HVKP獲得了碳青霉烯酶的編碼質粒[21]而產生的。目前CR-HVKP在亞洲特別是我國最流行的ST分型是ST11型。

本研究通過多重PCR同時擴增了wzyK1、wzyK2、wzyKL47和wzyKL64。肺炎克雷伯菌傳統的莢膜血清型至少有78種，與HVKP相關的有K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57等，其中最常見和最致命的莢膜血清型是K1和K2[11]。KL是基于肺炎克雷伯菌全基因組數據的莢膜合成位點的一個新的命名方法，KL47和KL64是ST11型菌株的2個最普遍的莢膜合成位點，也是我國目前分離的ST11型最常見的KL分型。通過對質粒圖譜進化樹的分析，發現KL47和KL64屬于兩個分支，所攜帶的質粒譜不同。KL47 rmpA幾乎全部定位于210 Kb質粒上，pLVPK類似的毒力質粒之間發生重組的頻率更高，而對于KL64，rmpA定位于大小相同的約210 Kb的質粒上，攜帶KL64的pLVPK質粒的毒力高于攜帶KL47的pLVPK質粒。本研究檢測的8株ST11型CR-HVKP的KL分型以KL64為主(87.5%)，這與文獻[4]報道的5株攜帶毒力質粒的ST11型肺炎克雷伯菌全部為局部單克隆傳播的KL47不相同，表明該院ST11型CR-HVKP并非單克隆傳播，同時也說明了該院分離出的實驗菌株的毒力比文獻[4]報道的菌株毒力更強。目前的研究表明，ST11型CR-HVKP的KL分型更多的是KL47[22]。

本課題采用3種多重PCR用于ST11型CR-HVKP的快速檢測：第1體系用于檢測CRKP和HVKP常見的ST型，包括ST11、ST258、ST23、ST86和ST65型等。第2體系鑒別與ST23、ST65、ST86型相關莢膜血清型K1、K2以及與ST11相關的KL47和KL64等。第3體系用于檢測毒力質粒pLVPK 相關的rmpA、rmpA2、iroN、intA 4種毒力基因。

通過對該院ST11型CR-HVKP進行分子流行病學分析，發現該院的CR-HVKP菌株87.5%來源于康復科。一方面，康復科患者大多來自連云港地區各大醫院，需長期住院康復治療，而長時間住院是耐藥的獨立危險因素；另一方面，共用康復設備，可能存在院內感染的風險。需要加強對CR-HVKP檢出科室的院內感染防控，減少CR-HVKP在患者之間的傳播，科學合理用藥。本研究的不足之處為沒有進一步驗證pLVPK毒力質粒的存在，可能存在一些pLVPK質粒攜帶的其他的毒力基因或毒力基因以外的毒力機制造成HVKP的高毒力。

綜上所述，該院檢出ST11型CR-HVKP 8株，以KL64為主，康復科檢出率最高，可能存在克隆株的散在傳播，需加強對康復科院內感染的防控。