lncRNA TUG1和PCAT-1表達水平與多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的關(guān)系及其診斷價值分析*

賀冠強，郭 敏，索曉慧，劉洪峰

河北省邯鄲市中心醫(yī)院血液內(nèi)科一病區(qū)，河北邯鄲 056001

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是以骨髓漿細胞惡性增殖為特點的漿細胞惡性腫瘤，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二，約占10%[1]。MM在西方國家的發(fā)病率約為6.5/10萬，以老年人群為主，我國MM的發(fā)病率低于西方國家，約為1.0/10萬[2]。雖然近年來MM的治療方法從傳統(tǒng)的化療發(fā)展到靶向藥物治療，但MM患者的生存率仍然較低，5年生存率為46.6%[3-4]。因此，尋找合適的生物標志物早期發(fā)現(xiàn)MM，對改善患者預(yù)后具有十分重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的長度大于200個核苷酸的片段，并不參與編碼蛋白質(zhì)，但是研究發(fā)現(xiàn)其可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達，參與機體的各種生理活動，也參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。已有研究顯示，lncRNA在多種腫瘤患者的血清中穩(wěn)定高表達，并與腫瘤患者的預(yù)后有關(guān)[7]，且多種lncRNA與MM的發(fā)病密切相關(guān)[8]。lncRNA牛磺酸上調(diào)基因1(TUG1)和lncRNA前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1(PCAT-1)近年來被發(fā)現(xiàn)參與了多種腫瘤包括MM的病理生理過程[9-10]，但是否與MM患者的預(yù)后有關(guān)尚不明確。因此，本研究通過檢測MM患者血清lncRNA TUG1和PCAT-1的表達水平，探討lncRNA TUG1和PCAT-1在MM中的作用，并分析其對MM預(yù)后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2016年11月于本院住院治療的MM患者90例作為MM組，患者均符合《血液病診斷及療效標準》[11]中MM的診斷標準，其中男51例，女39例；年齡41～78歲，平均(60.14±18.74)歲；按照美國血液病學(xué)會國際分期系統(tǒng)(ISS)[12]分為Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ期40例；按照M蛋白類型分為IgG型35例，IgD型32例，IgA型18例，輕鏈型 5例。納入標準：(1)符合MM的診斷標準；(2)病歷資料完整，患者入院時均進行血液生化、血常規(guī)、M蛋白類型鑒定等檢查；(3)年齡≤80歲；(4)均行VCD(硼替佐米+環(huán)磷酰胺+地塞米松)方案治療。排除標準：(1)病歷資料缺乏患者；(2)合并其他腫瘤的患者；(3)入院前已經(jīng)接受相關(guān)治療的患者；(4)精神疾病患者。選取同期本院體檢中心健康體檢者90例作為對照組，其中男49例，女41例；年齡41～76歲，平均(61.46±15.53)歲。MM組和對照組研究對象的性別和年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本院倫理委員會已批準本研究。所有研究對象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液標本采集 MM組患者于入院當(dāng)日清晨空腹采集靜脈血5 mL，對照組于體檢當(dāng)日清晨空腹采集靜脈血5 mL。室溫放置30 min，高速離心機提前預(yù)冷至4 ℃，將凝血后的血液在離心機中以3 000 r/min離心10 min，離心完畢后將血清轉(zhuǎn)移至新的離心管中做好編號標識，放于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測血清lncRNA TUG1和PCAT-1的表達水平 使用TRIzol試劑(美國Ambion公司)提取血清中的總RNA，測量RNA水平和純度，隨后使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照Takara實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系(10.0 μL)：cDNA 0.2 μL，正向引物(10.0 μmo/L) 0.5 μL，反向引物(10.0 μmo/L) 0.5 μL，ROXⅡ(50×) 0.2 μL，SYBR (2×) 5.0 μL，RNase free water 3.6 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，5 min；重復(fù)循環(huán)(40次)94 ℃，30 s→55 ℃，30 s→72 ℃，30 s；溶解曲線72 ℃，1 min。lncRNA TUG1正向引物：5′-AATGGCATGAACCTGGGAGGCG-3′；反向引物：5′-GGCTTTGGGAAGTGCTTTGGAG-3′；lncRNA PCAT-1正向引物：5′-GAGAGCTGACATAGGCACCC-3′；反向引物：5′-TCTC CACTGGTGTTCATGGC-3′；GAPDH正向引物：5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTG AAG-3′；反向引物：5′-TCCTT GGAGGCCATGTGGGCCAT-3′。

1.2.3臨床資料收集 收集MM患者性別、年齡、ISS分期、M蛋白類型，以及β2微球蛋白、C反應(yīng)蛋白水平等資料。根據(jù)MM患者lncRNA TUG1和PCAT-1表達水平的平均數(shù)，將MM組患者分為lncRNA TUG1高表達組(41例)、lncRNA TUG1低表達組(49例)，以及l(fā)ncRNA PCAT-1高表達組(37例)、lncRNA PCAT-1低表達組(53例)。根據(jù)MM患者的臨床病理特征，本研究將年齡分為<65歲和≥65歲，β2微球蛋白分為<3.5 μg/mL和≥3.5 μg/mL，C反應(yīng)蛋白分為<5.8 mg/L和≥5.8 mg/L，血紅蛋白分為<110 g/L和≥110 g/L，清蛋白分為<35 g/L和≥35 g/L，乳酸脫氫酶分為<170 U/L和≥170 U/L，Ca2+分為<10 mg/dL和≥10 mg/dL，按此分組進行研究。

1.2.4隨訪 MM患者出院后每半年進行1次隨訪，隨訪時間為3年，隨訪截止日期為2019年12月30日，采用電話隨訪或者上門隨訪，記錄患者的存活情況。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清lncRNA TUG1和PCAT-1的表達水平比較 MM組患者的血清lncRNA TUG1和PCAT-1表達水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清TUG1和PCAT-1的表達水平比較

2.2MM患者lncRNA TUG1和PCAT-1的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 lncRNA TUG1高表達組和lncRNA TUG1低表達組的年齡、β2微球蛋白和Ca2+水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組在性別、ISS分期、M蛋白類型，以及C反應(yīng)蛋白、血紅蛋白、清蛋白、乳酸脫氫酶水平方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；lncRNA PCAT-1高表達組和lncRNA PCAT-1低表達組的年齡、β2微球蛋白和Ca2+水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組在性別、ISS分期、M蛋白類型，以及C反應(yīng)蛋白、血紅蛋白、清蛋白和乳酸脫氫酶水平方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 MM患者lncRNA TUG1和PCAT-1的表達情況與臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2 MM患者lncRNA TUG1和PCAT-1的表達情況與臨床病理特征的關(guān)系

2.3lncRNA TUG1和PCAT-1的表達水平與MM患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年，隨訪過程中未出現(xiàn)失訪患者，生存人數(shù)為54例，生存率為60.00%，其中l(wèi)ncRNA TUG1高表達組的生存人數(shù)為18例，生存率為43.90%(18/41)，明顯低于lncRNA TUG1低表達組的73.47%(36/49)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.131，P=0.004)；lncRNA PCAT-1高表達組的生存人數(shù)為17例，生存率為45.95%(17/37)，明顯低于PCAT-1低表達組的69.81%(37/53)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.171，P=0.023)。

以因變量為MM患者3年中的生存情況(存活：0；死亡：1)，自變量見表3，單因素COX風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示：年齡、Ca2+、β2微球蛋白、lncRNA TUG1、PCAT-1表達水平與MM患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。建立多因素COX風(fēng)險回歸模型，因變量同上，將單因素分析中的年齡、Ca2+、β2微球蛋白、lncRNA TUG1、PCAT-1表達水平納入多因素COX風(fēng)險回歸模型，將連續(xù)型變量進行分層，轉(zhuǎn)變成二分類變量，分別進行賦值(年齡≥65歲=1，<65歲=0；β2微球蛋白≥3.5 μg/mL=1，<3.5 μg/mL=0；Ca2+≥10 mg/dL=1，<10 mg/dL=0；lncRNA TUG1和PCAT-1高表達=1，低表達=0)，使用后退法進行自變量的選擇(P<0.05)和剔除(P>0.10)。結(jié)果顯示，年齡較大、β2微球蛋白水平較高、lncRNA TUG1高表達和 PCAT-1高表達是影響MM患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 MM患者預(yù)后影響因素的COX風(fēng)險回歸模型

2.4lncRNA TUG1和PCAT-1對MM患者的診斷價值 采用ROC曲線分析lncRNA TUG1和PCAT-1對MM患者的診斷價值，如圖1所示，血清lncRNA TUG1曲線下面積為0.777(95%CI:0.704～0.850)，最佳臨界值為1.88，靈敏度和特異度分別為81.11%和77.78%；血清lncRNA PCAT-1曲線下面積為0.648(95%CI:0.566～0.729)，最佳臨界值為2.92，靈敏度和特異度分別為61.11%和67.78%。

注：A為TUG1；B為PCAT-1。

3 討 論

MM是血液系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，目前無法完全治愈，由于其發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者因為感染、腎功能不全或出現(xiàn)骨痛等癥狀前來就診，容易誤診，錯過最佳治療時機，嚴重影響MM患者的生活質(zhì)量和預(yù)后[13]。此外，MM異質(zhì)性較明顯，且患者病情進展程度差異較大，一些具有高危因素的MM患者生存率更低[14]。因此，準確識別這部分患者，對MM患者的個體化治療和預(yù)后具有十分重要的臨床意義。lncRNA在機體中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能，有研究顯示lncRNA參與了腫瘤的病理生理過程，可以作為腫瘤的預(yù)測因子[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，MM組患者血清lncRNA TUG1和PCAT-1表達水平高于對照組，提示TUG1和PCAT-1可能參與了MM的病理生理過程。

lncRNA TUG1是一個長約7.1 kb的RNA片段，最初發(fā)現(xiàn)其主要在視網(wǎng)膜和腦組織中表達，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)它在腫瘤發(fā)生過程中表達異常[10]。ISIN等[15]研究了5種不同的lncRNA，發(fā)現(xiàn)只有l(wèi)ncRNA TUG1表達水平在MM患者中明顯高于健康對照者，與本研究結(jié)果一致，表明血清lncRNA TUG1異常表達可能與MM的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，提示lncRNA TUG1可能是診斷MM的一種重要的生物標志物。本研究中的ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA TUG1曲線下面積為0.777(95%CI:0.704～0.850)，最佳臨界值為1.88，靈敏度和特異度分別為81.11%和77.78%，表明血清lncRNA TUG1在診斷MM時具有較高的價值，可以用來輔助診斷MM。一項研究顯示，lncRNA TUG1能與多梳蛋白抑制復(fù)合體2結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以集中到抑癌基因的啟動子區(qū)，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[16]，此外lncRNA TUG1還可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和Notch等多條信號通路促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[17-20]，但具體機制有待進一步研究。然而，lncRNA TUG1的表達水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系仍不明確，本研究發(fā)現(xiàn)MM患者血清lncRNA TUG1的表達水平與患者的年齡、β2微球蛋白、Ca2+水平相關(guān)，提示高齡、血清β2微球蛋白及Ca2+水平較高的患者容易出現(xiàn)lncRNA TUG1高表達。本研究進一步分析了不同血清lncRNA TUG1表達水平患者的預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1高表達組3年生存率顯著低于lncRNA TUG1低表達組，并且多因素COX風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示，lncRNA TUG1高表達是影響MM患者預(yù)后的危險因素，提示lncRNA TUG1高表達的患者預(yù)后較差，在治療過程中應(yīng)當(dāng)優(yōu)化lncRNA TUG1高表達MM患者的治療方案，改善其預(yù)后。

lncRNA PCAT-1已經(jīng)被證實是前列腺癌的致癌因子，可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的增殖并影響化療的敏感性，在多種腫瘤組織中表達明顯增加[20-21]。本研究顯示，MM組lncRNA PCAT-1表達水平明顯高于對照組，表明血清lncRNA PCAT-1異常表達可能與MM的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，提示lncRNA PCAT-1可能也是診斷MM的一種重要的生物標志物。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA PCAT-1曲線下面積為0.648(95%CI:0.566～0.729)，最佳臨界值為2.92，靈敏度和特異度分別為61.11%和67.78%，說明血清PCAT-1用來輔助診斷MM的價值較低，其靈敏度和特異度均低于lncRNA TUG1。有研究顯示，lncRNA PCAT-1通過干擾PHLPP/FKBP51/IKKα復(fù)合物激活A(yù)KT和NF-κB信號通路促進前列腺癌的發(fā)展[22]。HUANG等[23]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PCAT-1可以調(diào)控細胞周期，增加細胞周期蛋白的表達，通過外泌體途徑促進食管鱗狀細胞癌細胞增殖，但lncRNA PCAT-1是否通過上述途徑促進MM的發(fā)生尚需進一步探討。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清PCAT-1的表達水平與患者的年齡、β2微球蛋白和Ca2+水平相關(guān)，提示高齡、高血清β2微球蛋白及高血清Ca2+水平患者容易出現(xiàn)lncRNA PCAT-1高表達。進一步分析不同血清lncRNA PCAT-1表達水平患者的預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)lncRNA PCAT-1高表達組3年生存率顯著低于lncRNA PCAT-1低表達組，并且多因素COX風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示，lncRNA PCAT-1高表達是影響MM患者預(yù)后的危險因素，提示PCAT-1高表達的患者預(yù)后較差，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化診療方案，改善患者的生存質(zhì)量。

lncRNA TUG1和PCAT-1在MM患者中高表達，可以用來輔助診斷MM。lncRNA TUG1和PCAT-1高表達的患者預(yù)后較差，在診療過程中，應(yīng)優(yōu)化高表達患者的診療方案，改善患者預(yù)后。lncRNA TUG1和PCAT-1在MM患者中的作用機制有待進一步探討。