miR-20a對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響及與血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能

楊文玲，陳宗濤

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理科,重慶 400038

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率較高，約占肺癌總發(fā)病率的84%[1]。NSCLC的療效及預(yù)后與診斷有著密切關(guān)系，由于NSCLC早期并無(wú)明顯的臨床癥狀，臨床診斷過(guò)程中常出現(xiàn)漏診或者誤診的情況，從而延誤最佳治療時(shí)機(jī)[2-3]。近年來(lái)，腫瘤標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中受到越來(lái)越多的關(guān)注，有研究表明，腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可提高NSCLC的診斷效能，但是這些標(biāo)志物并非是NSCLC的特異性標(biāo)志物，所以其在NSCLC診斷中的應(yīng)用仍需不斷探討、考證[4]。本研究旨在探討血清腫瘤標(biāo)志物和miR-20a聯(lián)合檢測(cè)在NSCLC診斷中的價(jià)值，以期為NSCLC的臨床早期診療提供可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2013年1月至2015年1月收治的肺部疾病患者共206例，其中NSCLC患者[NSCLC組,在進(jìn)行手術(shù)切除時(shí)保留癌組織和癌旁組織(距癌組織>5 cm)標(biāo)本]112例，肺部良性疾病患者(良性肺病組)94例。NSCLC組中男58例，女54例；年齡45～76歲，平均(56.82±13.21)歲；腫瘤直徑為1.6～5.9 cm，平均(3.45±1.25)cm。良性肺病組中男48例，女46例；年齡44～75歲，平均(54.72±12.11)歲。所有患者均經(jīng)本院病理科明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎功能嚴(yán)重受損者；(2)近期接受過(guò)相關(guān)治療者；(3)長(zhǎng)期使用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素治療者；(4)精神疾病患者；(5)其他癌癥患者。受試者均簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1．2方法

1.2.1標(biāo)本采集 抽取10 mL空腹靜脈血于非抗凝管中，然后4 000 r/min離心10 min分離血清，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用于癌胚抗原(CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。抽取10 mL空腹靜脈血于抗凝管中，然后4 000 r/min離心10 min分離血漿，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用于miR-20a檢測(cè)。

1.2.2血清腫瘤標(biāo)志物及miR-20a水平檢測(cè) 采用電化學(xué)發(fā)光法(Roche Elecsys 2010)檢測(cè)血清CEA、NSE、糖類抗原(CA)125水平。采用TaqMan試劑盒(賽默飛世爾；ID:000580;序列:UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)miR-20a的表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中，48 h后消化傳代。采用LipofectamineTM2000試劑將miR-20a類似物(mimic-miR-20a)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞(該細(xì)胞來(lái)源于NSCLC細(xì)胞系)中，即mimic-miR-20a組，以僅加入LipofectamineTM2000試劑而未轉(zhuǎn)染miRNA模擬物/抑制劑(mimics/inhibitor)的細(xì)胞為對(duì)照，即mimic-NC組。等量接種A549細(xì)胞于6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)A549細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%的融合度，mimic-miR-20a組用mimics(終水平為50 nmol/L)轉(zhuǎn)染的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)約24 h。

1.2.4細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力檢測(cè) (1)CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)：將密度為105個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔接種200 μL。培養(yǎng)48 h后加入10 μL的CCK8試劑，孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。(2)Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將收集到的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后用400 μL的結(jié)合緩沖液(binding buffer)重懸，然后分別加入10 μL的Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)，避光孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平。(3)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：按照2×106個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后用20 μL的槍頭在6孔板上劃出劃痕，在0 h和24 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照，量取細(xì)胞的遷移距離。(4)碳酸脂膜(Transwell)侵襲實(shí)驗(yàn)：用基質(zhì)膠(matrigel)包被Transwell上層小室，加入200 μL DMEM重懸的密度為105個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，下層用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM填滿，培養(yǎng)48 h后將侵襲的細(xì)胞固定，用結(jié)晶紫染色，對(duì)侵襲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn) 以病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，CEA、NSE、CA125和miR-20a任意一項(xiàng)水平超過(guò)其臨界值判定為陽(yáng)性；全部指標(biāo)水平低于其臨界值判定為陰性。

2 結(jié) 果

2.1miR-20a在NSCLC組織中的表達(dá)水平及與患者生存率的相關(guān)性 與癌旁組織相比，miR-20a在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。經(jīng)過(guò)5年的隨訪，47例患者因肺癌死亡。采用Kaplan-Meier曲線分析miR-20a表達(dá)水平與患者生存率之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，miR-20a的表達(dá)水平與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)圖1～2。

2.2miR-20a對(duì)A594細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的調(diào)控作用 在A594細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-20a，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，miR-20a在A594細(xì)胞中有著較高的過(guò)表達(dá)效率(圖3A)。CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-20a可明顯促進(jìn)A594細(xì)胞的增殖(圖3B)，且流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證明過(guò)表達(dá)miR-20a后，A594細(xì)胞的凋亡水平明顯降低(圖3C)。此外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在A594細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-20a可明顯促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲(圖3D～E)。

2.3兩組血清腫瘤標(biāo)志物及miR-20a表達(dá)水平比較 NSCLC組患者血清CEA、CA125以及NSE的表達(dá)水平明顯高于良性肺病組(P<0.05)；另外，NSCLC組患者血漿miR-20a的表達(dá)水平明顯高于良性肺病組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

注：與癌旁組織比較，*P<0.05。

圖2 miR-20a的表達(dá)水平與NSCLC患者生存率的相關(guān)性

2.4血清腫瘤標(biāo)志物以及miR-20a在各組的檢出情況比較 NSCLC組患者CEA、NSE、CA125以及miR-20a的陽(yáng)性檢出率明顯高于良性肺病組；聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(上述指標(biāo)任意一項(xiàng)水平超過(guò)其臨界值)的患者在NSCLC組中所占的比例明顯高于良性肺病組。見(jiàn)表2。

注：A為miR-20a在A594細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效率；B為miR-20a對(duì)A594細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用；C為miR-20a對(duì)A594細(xì)胞凋亡水平的調(diào)控作用；D為miR-20a對(duì)A594細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用，以0 h作為參照；E為miR-20a對(duì)細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控作用；*P<0.05。

圖3 miR-20a對(duì)A594細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的調(diào)控作用表1 兩組血清腫瘤標(biāo)志物及miR-20a的表達(dá)水平比較

表2 兩組血清腫瘤標(biāo)志物及miR-20a檢出情況比較(n)

2.5血清腫瘤標(biāo)志物與miR-20a聯(lián)合檢測(cè)在NSCLC診斷中的價(jià)值 NSE診斷NSCLC的靈敏度為61.28%，特異度為84.66%，明顯高于其他血清腫瘤標(biāo)志物；miR-20a對(duì)NSCLC也有較高的靈敏度與特異度。CEA、NSE、CA125、miR-20a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC的診斷效能遠(yuǎn)高于各腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)檢測(cè)，其靈敏度達(dá)73.21%，特異度達(dá)91.49%，見(jiàn)表3。

表3 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能(%)

3 討 論

miRNA是一類不能編碼蛋白質(zhì)、長(zhǎng)度小于25個(gè)核苷酸的小RNA，研究表明，miRNA的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著緊密的聯(lián)系[5]。本研究表明，miR-20a高表達(dá)于NSCLC組織中，且過(guò)表達(dá)的miR-20a可顯著促進(jìn)A594細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移。許榮譽(yù)等[6]研究表明，miR-20a在NSCLC組患者血漿中的表達(dá)水平及陽(yáng)性檢出率明顯高于良性肺病組患者，且miR-20a的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系，與本研究結(jié)果基本一致。

鑒于miR-20a在NSCLC組織中的生物作用，筆者認(rèn)為miR-20a還可以在NSCLC的診斷試驗(yàn)中起作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a在NSCLC組患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于良性肺病組患者，并且其靈敏度為58.04%，特異度為80.85%。因此，筆者認(rèn)為miR-20a可以作為NSCLC診斷試驗(yàn)中的一個(gè)生物標(biāo)志物。

此外，本研究還探討了CEA、NSE和CA125在NSCLC診斷中的價(jià)值，結(jié)果顯示，CEA高表達(dá)于NSCLC患者血清，NSCLC患者CEA陽(yáng)性檢出率明顯高于肺部良性疾病患者，但是其對(duì)NSCLC的特異度和靈敏度較低。CEA是一種由胃腸道分泌的糖蛋白，具有胚胎抗原特異性。早期的研究表明，血清中CEA的高表達(dá)與大腸癌的發(fā)病息息相關(guān)，因此可作為大腸癌的特異性標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷[7-8]。隨著研究的深入，CEA在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤中的異常表達(dá)逐漸被發(fā)現(xiàn)，因此CEA被當(dāng)作腫瘤診斷標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于臨床，并且許多研究報(bào)道指出，其在NSCLC的診斷中有重要意義[9-10]。

本研究中NSCLC患者血清NSE水平以及陽(yáng)性檢出率均明顯高于肺部良性疾病患者，并且其特異度和靈敏度較高，分別為84.56%、61.28%。NSE特異性地存在于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，由于NSCLC屬于神經(jīng)內(nèi)分泌類腫瘤，因此NSE對(duì)NSCLC的診斷具有較高的特異度與靈敏度[11]。

相較于肺部良性疾病患者，NSCLC患者血清CA125水平和陽(yáng)性檢出率明顯升高，且CA125診斷NSCLC的靈敏度達(dá)51.79%，特異度達(dá)75.26%。CA125是一種儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白，正常情況下由于細(xì)胞間連接和基底膜的阻擋,CA125無(wú)法進(jìn)入血液循環(huán)，因此健康人血液中CA125水平極低。當(dāng)組織出現(xiàn)癌性病變時(shí)，細(xì)胞之間的連接及基底膜遭到破壞，血液中的CA125水平會(huì)明顯升高[12-14]。隨著研究的深入，不少報(bào)道指出，其在肺癌患者血清中的陽(yáng)性檢出率偏高，且其診斷肺癌的靈敏度為30%～60%，特異度為34%～67%[15]，這與本研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，CEA、NSE、CA125及miR-20a作為NSCLC的診斷標(biāo)志物各有優(yōu)點(diǎn)，但是單獨(dú)使用時(shí)的特異度和靈敏度并不理想。本研究將3種血清腫瘤標(biāo)志物與血漿miR-20a聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于診斷NSCLC的靈敏度和特異度均高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)，這提示miR-20a、CEA、NSE及CA125聯(lián)合檢測(cè)可能更具有診斷價(jià)值。