SPINK7對IL-22介導的角質細胞異常增殖及炎癥應答的影響①

張鼎偉 張燕飛 汪 煒 霍 佳 楊珮雯 張鈺匯 王 媛

(西安交通大學第二附屬醫院皮膚科，西安 710004)

銀屑病是一種T細胞介導的常見的慢性炎癥性皮膚病，主要表現為表皮角質形成細胞過度增殖，分化異常，免疫細胞浸潤，促炎細胞因子釋放等[1]。盡管其發病潛在機制非常復雜，尚不明確，但免疫功能障礙在該病的發病過程中起著至關重要的作用，特別是T細胞和角質形成細胞介導的免疫反應參與了銀屑病的發生和維持。免疫細胞產生大量的細胞因子，如IL-17、IFN-γ、TNF-α和IL-22，這些細胞因子又作用于角質形成細胞以加重銀屑病炎癥，最終導致角質形成細胞的增殖、分化、凋亡異常，形成了臨床可見的銀屑病特征性皮損[2]。

免疫系統在銀屑病的發病過程中起著至關重要的作用，免疫細胞產生的大量炎癥細胞因子促進角質形成細胞的增殖。在銀屑病的皮膚區域，促炎細胞因子和趨化因子的表達升高，吸引免疫細胞，導致局部和侵襲細胞的增殖。IL-17、IL-22、TNF-α等多種炎癥因子被認為是銀屑病的重要病理因素。IL-22主要是由多種免疫細胞比如Th17和Th22產生，在T細胞介導的免疫應答中發揮重要作用[3]。IL-22通過誘導角質形成細胞快速增殖，并特異性表達IL-22受體，從而導致銀屑病的發病[4]。此外，IL-22在銀屑病患者的血清中高表達，且與疾病嚴重程度呈正相關[5]。IL-22在銀屑病的發病機制中發揮非常重要的作用，常被用于體外誘導角質形成細胞炎癥或異常增生作為銀屑病的研究模型[6]。

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor kazal type，SPINK)家族是一類具有Kazal結構域的絲氨酸蛋白酶抑制劑，與多種人類疾病發生、發展密切相關[7]。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子7(SPINK7)，又名食管癌相關基因2(ECRG2)是SPINK家族的重要成員，與皮膚等組織的炎癥性疾病相關。有研究報道SPINK7在銀屑病和濕疹等炎癥性皮膚病中表達上調[8]。本研究通過利用IL-22刺激人角質形成細胞HaCaT細胞建立的炎癥模型，探討SPINK7對IL-22誘導人角質形成細胞HaCaT增殖能力及炎癥應答的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 HaCaT角質形成細胞購自中國科學院昆明細胞庫；胎牛血清、DMEM培養基和胰酶購自美國Gibco公司；MTT試劑盒和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Trizol試劑盒和細胞轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；IL-23、TNF-α和IL-17A檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；anti-SPINK7抗體購自美國Invitrogen公司；anti-cyclin D1、anti-survivin、anti-β-catenin和anti-c-Myc抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；anti-β-actin抗體購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將HaCaT置于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養液，于37℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞貼壁后更換新鮮的完全培養液，繼續培養、傳代。選擇對數生長期的細胞進行試驗。用100 ng/ml IL-22刺激HaCaT細胞，模擬銀屑病炎癥模型。

1.2.2SPINK7 siRNA序列為5′-AAAGTAATGGAAGAGTTCAGTTT-3′，由上海GenePharma公司合成。使用BgⅢ和HindⅢ限制酶將siRNA寡核苷酸序列克隆至pSUPER.Retro.puro逆轉錄病毒載體，構建pSUPER.Retro.puro-SPINK7-siRNA質粒，并經測序分析驗證。

1.2.3RT-PCR檢測mRNA表達 采用TRIzol法按照說明書步驟提取細胞總RNA，紫外分光光度計進行RNA定量。按逆轉錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Green Master熒光定量PCR試劑在7900HT熒光定量PCR儀上進行反應以檢測目的基因的mRNA相對表達量。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 轉染后48 h，收集各組細胞，提取細胞總蛋白，通過BCA法檢測總蛋白濃度。運用SDS-PAGE分離蛋白質，電轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；用ECL化學發光劑孵育，顯色終止后用凝膠成像儀進行拍照采集圖片，并用Image J圖像分析軟件進行條帶的灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.5MTT法檢測細胞活力 將各組細胞接種至96孔板中，每孔細胞數為5×103個，放置于細胞培養箱中孵育。轉染24 h后棄去培養基，每孔加 20 μl 濃度為5 mg/ml的MTT培養液，37℃培養箱中繼續孵育4 h，棄去上清，每孔加150 μl DMSO室溫振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用全自動酶標儀在 490 nm 波長處測定各孔吸光度值。

1.2.6ELISA法檢測細胞上清液中的IL-23、TNF-α和IL-17A 收集各組細胞上清液，采用ELISA法分別檢測上清液中IL-23、TNF-α和IL-17A的表達水平，參照ELISA試劑盒說明書分別測定450 nm波長處各孔吸光度值。

2 結果

2.1IL-22誘導HaCaT細胞中SPINK7高表達 檢測IL-22刺激對HaCaT細胞中SPINK7表達量的影響，結果如圖1所示，HaCaT細胞經IL-22處理后，SPINK7的mRNA和蛋白表達水平均顯著上調，說明IL-22能夠誘導SPINK7表達上調。為進一步研究SPINK7在銀屑病發病機制中的作用，采用小干擾RNA技術抑制HaCaT細胞中SPINK7表達量，并利用RT-PCR和Western blot檢測SPINK7的mRNA和蛋白表達水平以評價轉染是否成功。結果如圖1所示，si-SPINK7轉染有效降低了HaCaT細胞中SPINK7的表達水平。

2.2SPINK7沉默抑制IL-22誘導的HaCaT細胞增殖 IL-22可誘導培養的角質形成細胞的增殖。為研究SPINK7是否能夠參與調節角質形成細胞增殖，MTT法檢測結果如圖2A顯示，與Control組相比，IL-22作用于HaCaT細胞后可明顯誘導細胞增殖；而SPINK7沉默對IL-22誘導的細胞增殖有明顯的抑制作用；該結果表明SPINK7沉默顯著抑制IL-22-誘導的HaCaT細胞生長。進而利用Western blot檢測SPINK7沉默對IL-22刺激的HaCaT細胞中cyclin D1及survivin表達的影響。結果如圖2B、C顯示，IL-22刺激顯著上調cyclin D1及survivin表達量；而SPINK7沉默后，cyclin D1及survivin表達水平明顯降低。由此推測SPINK7沉默可能通過下調cyclin D1及survivin表達從而抑制IL-22誘導的HaCaT細胞生長。

2.3沉默SPINK7抑制IL-22誘導的HaCaT細胞炎癥損傷 RT-PCR檢測SPINK7對IL-22刺激的炎癥反應的影響，結果如圖3A、C所示，與Control組相比，IL-22誘導HaCaT細胞中IL-23、TNF-α和IL-17A mRNA的表達水平均顯著升高；而沉默SPINK7后能夠降低炎癥因子IL-23、TNF-α和IL-17A的mRNA的水平。進一步用ELISA檢測上清中細胞因子分泌水平，結果如圖3D～F顯示，IL-22處理后促炎癥細胞因子IL-23、TNF-α和IL-17A的含量均有所增加；抑制SPINK7后顯著降低細胞上清中IL-23，TNF-α和IL-17A的表達量。上述結果表明SPINK7沉默通過下調炎癥因子表達，阻斷IL-22誘導的炎癥反應，從而發揮對角質形成細胞的保護作用。

圖1 IL-22誘導的HaCaT細胞中SPINK7高表達Fig.1 SPINK7 was enhanced in IL-22-stimulated HaCaT cellsNote:A.The mRNA expression of SPINK7 was detected using RT-PCR assay；B.Western blot analysis was conducted to measure the protein level of SPINK7.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

圖2 SPINK7對IL-22誘導HaCaT細胞增殖的影響Fig.2 Effects of SPINK7 on IL-22-induced HaCaT cell proliferationNote:A.MTT assay was applied to evaluate cell proliferation；B and C.The protein expression of cyclin D1 and survivin was determined using Western blot analysis.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

圖3 SPINK7對IL-22誘導的HaCaT細胞炎癥反應的影響Fig.3 Influence of SPINK7 on IL-22-stimulated inflam-mation response in HaCaT cellsNote:A～C.The mRNA expression of inflammation factors IL-23,TNF-α and IL-17A was evaluated using RT-PCR assay；D～F.ELISA assay was performed to estimate the production of inflammation mediators.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

圖4 SPINK7對Wnt/β-catenin信號通路的影響Fig.4 Effects of SPINK7 on Wnt/β-catenin signalingNote:Western blot was applied to detect the expression of β-catenin and c-Myc.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

2.4沉默SPINK7抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活 Western blot法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達水平，結果如圖4顯示，IL-22刺激顯著增加Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白β-catenin表達量，其下游靶基因c-Myc表達水平也明顯升高，從而激活Wnt/β-catenin信號通路；SPINK7沉默后，β-catenin和c-Myc的蛋白表達水平下降，提示沉默SPINK7能夠抑制IL-22激活的Wnt/β-catenin信號通路。

3 討論

銀屑病是一種以角質形成細胞異常增殖分化和免疫細胞浸潤為特征的慢性炎癥性皮膚病。HaCaT細胞為人永生化的角質形成細胞，具有無限增殖、易培養、穩定性好等特點，且其生物學特性與人原代角質形成細胞幾乎一致。因此，本研究采用IL-22刺激HaCaT細胞體外模擬角質形成細胞過度增殖的病理狀態即類銀屑病病理模型。有研究報道SPINK7在銀屑病中高表達，而本實驗表明IL-22處理導致SPINK7的mRNA及其蛋白表達顯著升高，說明SPINK7在銀屑病發展中具有重要作用。

角化細胞的過度增殖和皮膚組織的持續炎癥是銀屑病的主要病理過程。角質形成細胞異常、過度、快速增殖是皮膚病變的重要原因，已知各種因素可導致角質形成細胞過度增殖。Cyclin D1是原癌基因，在細胞G1/S轉換中起促進作用；survivin是凋亡蛋白抑制劑家族中的成員，是迄今發現的作用最強的凋亡抑制因子，具有促進細胞增殖的作用。本研究發現SPINK7沉默對IL-22誘導的HaCaT細胞異常增殖具有明顯抑制作用。同時SPINK7沉默明顯抑制IL-22誘導的HaCaT細胞中cyclin D1和survivin表達，提示SPINK7沉默可能通過抑制cyclin D1和survivin的表達發揮抑制IL-22誘導的HaCaT細胞增殖。

銀屑病是一種慢性皮膚炎癥性疾病，控制病理過程中的炎癥反應將有助于銀屑病疾病的預防和治療。大量文獻表明，免疫系統在銀屑病發病機制中發揮著關鍵作用，免疫細胞產生的大量炎癥細胞因子(IL-17、IL-22等)能夠促進角質形成細胞的增殖[9]。有證據表明，趨化因子和炎癥細胞因子的異常分泌導致了疾病的進展[10]。在參與炎癥反應的眾多介質中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17都是與炎癥密切相關的因子，參與HaCaT細胞的炎癥反應。而IL-23、Th17軸在銀屑病發生發展中起重要作用[11]。本實驗結果顯示，IL-22刺激明顯導致HaCaT細胞內促炎癥因子IL-23、TNF-α和IL-17A的表達水平顯著上升，而SPINK7沉默后抑制這些炎癥因子的分泌，從而減輕細胞的炎癥反應。上述結果提示沉默SPINK7可能通過抑制增殖及炎癥因子的釋放，從而發揮抗銀屑病的作用，SPINK7有望成為銀屑病治療的新靶點。

進一步探討沉默SPINK7對IL-22誘導HaCaT增殖和炎癥應答調控的分子機制。Wnt/β-catenin信號通路涉及機體的生長、發育以及細胞的增殖、凋亡等重要過程。已有研究表明Wnt/β-catenin通路異常激活與銀屑病的發生密切相關[12-13]。本研究通過Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路關鍵分子，結果發現IL-22處理后，β-catenin和c-Myc蛋白表達水平均明顯上調而激活Wnt/β-catenin通路，但是沉默SPINK7能夠顯著降低β-catenin和c-Myc的表達，表明SPINK7沉默可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，提示SPINK7沉默導致的對HaCaT細胞異常增殖和炎癥反應的抑制作用可能與調控Wnt/β-catenin信號通路的激活有關。

綜上所述，沉默SPINK7可有效抑制IL-22誘導HaCaT細胞異常增殖和炎癥反應，該過程可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活有關。了解SPINK7在銀屑病發病機制和Wnt/β-catenin信號通路中的確切作用有望為尋常型銀屑病的發病機制及治療的研究提供一個新的思路，為本課題組進一步的研究奠定了基礎。