養(yǎng)正合劑和粒細胞集落刺激因子對化療后骨髓功能的影響①

寇小妮 朱 江

(陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肝病二科，咸陽 712000)

化療始終是現(xiàn)階段及將來很長一段時間內(nèi)治療惡性腫瘤的重要手段，對于控制病灶、緩解癥狀及延長生存期均有重要作用。然而，化療藥物在治療多種腫瘤時常常伴有骨髓抑制、惡心嘔吐、疲勞、腹瀉、脫發(fā)等副作用，如廣譜抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺(Cytoxan，CTX)屬于細胞周期非特異性化療藥物，對增殖周期中各期細胞的殺滅作用突出，對粒細胞的影響更為明顯，其典型毒副作用即為骨髓抑制(白細胞下降等)[1-2]。如何消除或減輕CTX等化療藥物所帶來的毒副反應已成為臨床上亟待攻克的難題。事實上，大部分骨髓抑制需藥物治療，臨床上常給予集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)，但CSF致白血病的觀點已得到證實，且其本身可引起多種不良反應，加之價格較高限制了其應用[3-4]；與此同時，祖國醫(yī)藥在減輕骨髓抑制等化療毒副反應方面有獨到優(yōu)勢[5]，近年來臨床對中藥配方制劑及單體成分作用的關注有增無減。現(xiàn)設計隨機對照動物實驗，以CTX致骨髓功能抑制小鼠模型，觀察養(yǎng)正合劑和rhG-CSF對化療后骨髓功能的影響，并研究其可能機制，以期為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雌性C57BL/6小鼠共50只，雌雄各半，購自本市醫(yī)科學院實驗動物中心，6～8周齡，體重18～22 g。實驗小鼠均飼養(yǎng)于12 h光明/12 h黑暗、20～26℃(溫差不低于3℃)、濕度40%～70%且無特定病原體污染級別環(huán)境中，自由攝食與飲水，適應性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。小鼠均予以編號，建模后以隨機數(shù)字表法分為5組：空白組、模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組，各10只。本研究獲動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2主要藥品與儀器 注射用CTX購自上海華聯(lián)制藥有限公司；中藥配方制劑養(yǎng)正合劑購自陜西步長制藥有限公司(國藥準字Z10970042)；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，rhG-CSF)購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司(國藥準字S19980010)；血清可溶性L-選擇素(sL-selectin,sCD62L)、粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)ELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司；免疫組化檢測試劑盒購自丹麥DAKO公司；高速冷凍離心機購自湖南湘儀離心機儀器有限公司；光學顯微鏡購自日本Nikon公司；全自動血細胞分析儀購自日本SYSMEX公司。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 參照文獻[6]改良方法，以ip CTX方法制備骨髓功能抑制小鼠模型。模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑組小鼠給予CTX生理鹽水溶液40 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d，空白組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2給藥 空白組、模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組于建模后(實驗第4天)分別給予生理鹽水(0.2 ml)、生理鹽水(0.2 ml)、rhG-CSF(30 μg/kg)、養(yǎng)正合劑(4 mg/kg)及養(yǎng)正合劑(8 mg/kg)腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d(實驗第4～14天)。每日密切觀察小鼠生存狀態(tài)，各組動物在第14天處死并完成各項檢測。

1.2.3檢測指標 ①將實驗開始(化療)前檢測的指標作為基線水平，即d 0；分別于注射前及注射開始后第3、5、7、10、14天在眼底靜脈叢采血50 μl，3 000 r/min 離心處理(離心半徑15 cm)10 min后取血清標本，以ELISA法測定血清sCD62L、GM-CSF水平；并在離心處理前通過肝素抗凝后以全自動血液細胞分析儀測定外周血白細胞(white blood cell，WBC)、紅細胞(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、中性粒細胞絕對數(shù)(absolute neutrophil number，ANC)及血小板(platelet，PLT)含量，繼而明確各組外周血象下降與恢復情況。②脾指數(shù)測算，于末次給藥后24 h處死小鼠取脾臟，除去表面結締組織并用濾紙吸干表面血液，迅速稱質(zhì)量，并計算脾臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，即為脾指數(shù)。③骨髓形態(tài)學分析，各組小鼠處死后取骨髓組織，切片后進行HE染色，顯微鏡下觀察，并以圖像分析軟件測定骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比。

2 結果

2.1各組小鼠血清sCD62L、GM-CSF及外周血象變化比較 ①模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)合劑2組CTX注射后第7天， 血清sCD62L、GM-CSF水平及外周血WBC、RBC、HGB、ANC、PLT明顯降低， 與同組d0時相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②rhG-CSF組血清GM-CSF及外周血象各項指標在第10天、14天逐漸達到空白組水平，但血清sCD62L水平始終處于較高水平；養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組血清sCD62L水平在第10天、14天恢復至空白組水平，外周血象各項指標逐漸接近空白組水平。③第14天，血清sCD62L水平比較，rhG-CSF組>模型組>養(yǎng)正合劑1組>養(yǎng)正合劑2組；血清GM-CSF及外周血RBC、HGB、ANC、PLT比較，模型組<養(yǎng)正合劑1組<養(yǎng)正合劑2組

2.2各組小鼠脾指數(shù)及骨髓形態(tài)學分析結果比較 末次給藥后24 h， rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組脾指數(shù)均顯著低于模型組，骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比顯著高于模型組(P<0.05)；其中rhG-CSF組脾指數(shù)、骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比與空白組接近(P>0.05)，養(yǎng)正合劑2組脾指數(shù)明顯低于養(yǎng)正合劑1組，骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比明顯高于養(yǎng)正合劑1組(P<0.05)；但養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組與rhG-CSF組、空白組相比差異仍有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表1。

圖1 各組小鼠血清sCD62L、GM-CSF及外周血象變化Fig.1 Changes of serum sCD62L, GM-CSF and peripheral hemogram in mice of each groupNote:A.Serum sCD62L;B.Serum GM-CSF;C.Peripheral blood WBC;D.Peripheral blood RBC;E.Peripheral blood HGB;F.Peripheral blood ANC;G.Peripheral blood PLT.

圖2 各組小鼠骨髓形態(tài)學表現(xiàn)示例(HE染色，×400)Fig.2 Example of bone marrow morphology of mice in each group (HE staining,×400)Note:A.Blank group mice;B.Model group mice;C.rhG-CSF group mice;D.YangZheng compound mixture group 1 mice;E.YangZheng compound mixture group 2 mice.

表1 各組小鼠脾指數(shù)及骨髓形態(tài)學分析結果比較

3 討論

骨髓抑制是化療后嚴重且常見毒副反應之一，也是血液系統(tǒng)常見的、 可危及生命的毒性反應， 外周血中WBC為主的全血細胞下降為主要特征，WBC下降也是最常見、最早出現(xiàn)的異常情況，其次為PLT、RBC、HGB、ANC減少或下降，故骨髓抑制往往伴貧血、出血、抗感染能力下降等嚴重不良反應，可較大程度影響腫瘤治療與預后[7-8]。對于化療藥物引起骨髓抑制的主要機制，當前文獻大多支持的觀點是藥物對造血干細胞的損傷，同時損傷骨髓基質(zhì)細胞的結構與功能[9]。為改善或避免化療藥物對骨髓功能的損害，長久以來臨床進行了大量實驗和研究，已證實CSF對于促進骨髓內(nèi)造血細胞增殖并進入外周血有顯著作用，可明顯減輕或緩解化療后的骨髓功能抑制，但也有報道指出CSF長期大量應用是增加白血病發(fā)病的危險因素，且其能刺激某些腫瘤細胞生長[10-11]；另有研究發(fā)現(xiàn)部分腫瘤患者化療后骨髓造血細胞增殖本身即為活躍而非抑制狀態(tài)，加之CSF價格較高，注射方式繁雜，也可引發(fā)不良反應(發(fā)熱、骨骼酸痛等)，故臨床對CSF使用存在一定質(zhì)疑[12]。對于骨髓功能抑制，臨床實際中常予以針對性治療，較少預防，急需新藥研發(fā)。

中醫(yī)藥在治療骨髓抑制方面已被證實有一定療效，現(xiàn)代藥理學表明其機制主要包括促進造血祖細胞分化與增殖，激活造血生長因子、造血祖細胞因子表達，促進T淋巴細胞增殖及增強NK細胞活性等[13-14]。從中醫(yī)學角度看，骨髓抑制歸屬于“虛勞-血虛”范疇，認為血的生成與脾緊密相關，即血液化生過程起初通過外界攝取食物，后經(jīng)脾胃運化為生成血液的物質(zhì)基礎，而后化生為氣血，故而脾胃化源是否充足直接影響氣血充盈程度。有學者指出，對于化療藥物引起的氣血虧虛，健脾益氣法治療能夠培補脾胃之本，增強氣血生化之源[15]。養(yǎng)正合劑主要由紅參、黃芪、枸杞、女貞子、豬苓、茯苓6味中藥制成，具有益氣健脾、滋肝養(yǎng)腎的作用，早期研究已證實其能增強人體免疫力，用于治療腫瘤患者化療后引起的氣陰兩虛及緩解神疲乏力、少氣懶言、五心煩熱、口干咽燥等癥狀有顯著效果[16-17]。

本研究中，除空白組外，各組CTX注射后第7天血清sCD62L明顯升高，GM-CSF及外周血WBC、RBC、HGB、ANC、PLT降低，表明CTX可致骨髓功能抑制，且骨髓抑制狀態(tài)下血清sCD62L表達升高，GM-CSF表達降低。為了進一步明確養(yǎng)正合劑改善骨髓功能抑制的作用，本實驗以rhG-CSF干預為對照，對養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組小鼠給予小劑量、大劑量養(yǎng)正合劑干預，發(fā)現(xiàn)rhG-CSF組血清GM-CSF及外周血象各項指標在第10天、14天逐漸達到空白組水平，但血清sCD62L水平始終處于較高水平，進一步證實rhG-CSF促進粒細胞集落刺激因子產(chǎn)生，繼而促進GM-CSF表達，改善外周血象；而養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組血清sCD62L水平在第10天、14天恢復至空白組水平，外周血象各項指標逐漸接近空白組水平，提示養(yǎng)正合劑可降低化療后骨髓抑制狀態(tài)小鼠血清sCD62L表達、改善外周血象。事實上，早期有研究指出骨髓抑制的重要原因之一在于骨髓內(nèi)成熟造血細胞釋放功能障礙，證實CD62L參與了粒細胞釋放過程，即低表達CD62L的細胞易于進入外周血，反之，高表達CD62L的細胞則會粘附在血竇內(nèi)皮細胞上阻礙其釋放[18]。因此推測養(yǎng)正合劑可降低骨髓粒細胞CD62L表達，保護骨髓粒細胞系統(tǒng)從而調(diào)節(jié)骨髓粒細胞釋放功能障礙，促進骨髓粒細胞釋放入血，達到促進血細胞進入外周血液而恢復外周血象的目的，但確切機制有待進一步闡明。需指出的是，第14天，血清sCD62L水平rhG-CSF組>模型組>養(yǎng)正合劑1組>養(yǎng)正合劑2組，GM-CSF及RBC、HGB、ANC、PLT水平模型組<養(yǎng)正合劑1組<養(yǎng)正合劑2組

作為主要的外周免疫器官，脾臟是T、B細胞接受血源性刺激分化成熟并產(chǎn)生效應T細胞與漿細胞的主要部位，其功能狀態(tài)直接決定了機體能否發(fā)揮正常的免疫功能，脾指數(shù)在一定程度上直接體現(xiàn)機體免疫功能狀態(tài)，也被眾多研究作為評估骨髓功能的實驗指標[19-20]。本實驗末次給藥后24 h，rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組脾指數(shù)均低于模型組，骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比高于模型組，提示rhG-CSF、養(yǎng)正合劑均可有效降低脾指數(shù)，增強小鼠免疫功能及骨髓造血功能。近期研究證實紅參、黃芪配伍能促進造血、增強免疫功能[21]。本實驗養(yǎng)正合劑2組小鼠脾指數(shù)、骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比改善效果優(yōu)于養(yǎng)正合劑1組，但與rhG-CSF組、空白組相比仍有明顯差異，表明大劑量養(yǎng)正合劑增強免疫功能、提升骨髓造血功能的效果優(yōu)于小劑量，雖然二者的改善作用不如rhG-CSF強烈，但養(yǎng)正合劑促進粒細胞集落刺激因子產(chǎn)生的作用可能更緩和、持久，可能與兩種藥物作用機制、藥效時間差異有關。陳凌波等[22]實驗顯示黃芪當歸配伍可通過促進骨髓粒細胞釋放來提高外周血象指標，作用緩和而持久，而rhG-CSF主要機制為促進骨髓粒細胞增殖，作用強烈，或可解釋為何本實驗養(yǎng)正合劑的改善作用不如rhG-CSF顯著，但其具體原因仍需進一步探究。