lncRNA HOXA11-AS對膀胱尿路上皮癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及其機制研究①

夏儒銳 梁培育 王聲興 歐善際 彭曉暉

(海南醫學院第一附屬醫院泌尿外科，?？?570102)

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，以膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)最為常見，其易復發和轉移性及術后并發癥導致患者生存質量降低，患者5年生存率低于15%[1]。研究其發展的分子機制對疾病的靶向治療極其重要。研究表明，lncRNA和miRNA在可作為預測BUC患者生存和預后的獨立標志物[2-3]。有報道，lncRNA HOXA11-AS(homeobox A11-antisense RNA)在肝癌組織、骨肉瘤組織和細胞及口腔鱗狀細胞癌組織中高表達，其過表達可促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖，抑制其表達可抑制肝癌和骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力[4-6]。本研究通過生物信息學預測，發現miR-515-5p可能是lncRNA HOXA11-AS的靶基因。MiR-515-5p在前列腺癌、非小細胞肺癌和胃癌細胞中表達下調，過表達miR-515-5p可抑制癌細胞的增殖或轉移[7-9]。但lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC中的表達、對癌細胞的影響及兩者的關系目前還尚未可知。本研究探尋HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC細胞增殖、遷移、侵襲中的作用機制，以期為BUC的診斷治療提供新的分子生物學靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本 選取2016年6月至2017年12月于本院病理檢查確診為BUC的患者手術切除的BUC組織及癌旁組織(距離BUC組織邊緣>1.5 cm)各20例，男16例，女4例，年齡26～80歲，平均年齡(49.5±16.6)歲，按照2006年WHO標準分類，浸潤性14例，非浸潤型6例。所有患者術前未接受放療和化療。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準，并與所有患者簽訂知情同意書。

1.1.2試劑及儀器 人BUC細胞株J82購自ATCC；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和MEM培養基購自美國Gibco公司，Total RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)、Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；四氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶Trypsin購自美國Sigma-Aldrich公司；Cyclin D1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14和GAPDH抗體購自美國Santa公司；lncRNA HOAX11-AS抑制劑(si-HOAX11-AS)、HOAX11-AS過表達載體(pcDNA-HOXA11-AS)、miR-515-5p模擬物(miR-515-5p)、miR-515-5p模擬物(miR-515-5p)、陰性對照(si-NC、pcDNA、anti-miR-NC和miR-NC)和HOXA11-AS野生型(WT-HOXA11-AS)、突變型(MUT-HOXA11-AS)雙熒光素酶載體購自蘇州吉瑪基因公司；Transwell板購自美國Corning公司；雙熒光素酶報告系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；光學顯微鏡、全自動酶標儀、發光儀及RT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將J82細胞培養在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的MEM培養液中，培養條件：濕度95%，37℃，5%CO2培養箱中培養。傳代保存。

1.2.2細胞轉染 轉染前24 h，收集對數生長期的J82細胞，胰蛋白酶消化，將細胞稀釋為1×106個/ml，以2×105個/孔接種于6孔板，培養至融合度達到80%時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。轉染分組：HOXA11-AS干擾組(轉染si-NC和si-HOXA11-AS)；miR-515-5p過表達組(轉染miR-NC和miR-515-5p)；HOXA11-AS過表達組(轉染pcDNA和pcDNA-HOXA11-AS)；miR-515-5p和HOXA11-AS雙抑制組(共轉染si-HOXA11-AS+anti-miR-NC、si-HOXA11-AS+anti-miR-515-5p)，雙熒光素酶報告系統組(共轉染miR-NC+WT-HOXA11-AS、miR-515-5p+WT-HOXA11-AS、miR-NC+MUT-HOXA11-AS和miR-515-5p+MUT-HOXA11-AS)。轉染48 h，收集細胞進行后續實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-515-5p和lncRNA HOXA11-AS的表達 用總RNA提取試劑盒從BUC組織、癌旁組織和培養的J82細胞中提取總RNA，然后反轉錄試劑盒合成cDNA，合成的cDNA檢測后于-80℃保存。取cDNA按照qRT-PCR的說明書進行反應合成lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p，反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃ 44 s、72℃ 30 s，45個循環；72℃延伸10 min。用2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.4MTT實驗測定細胞增殖 轉染48 h后，胰蛋白酶消化J82細胞，離心后培養基重懸細胞，將細胞稀釋濃度為1×105個/ml，以200 μl/孔接種于96孔板，繼續培養，分別在培養至24 h、48 h和72 h時，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續培養4 h，棄上清培養液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.2.5Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲 遷移實驗：收集轉染后各組J82細胞，用不含FBS的MEM培養基過夜饑餓培養，用胰蛋白酶消化細胞，用無血清培養基稀釋細胞為1×105個/ml。在Transwell下層培養孔加入500 μl含10%FBS的MEM培養基作為遷移趨化物，Transwell上層小室加入100 μl稀釋的J82細胞，再將上層小室放入下層培養孔中，置 CO2培養箱培養24 h，用棉簽拭去上層小室未遷移的細胞，甲醛固定遷移細胞，結晶紫染色，顯微鏡觀察計數遷移細胞。侵襲實驗：用4℃無血清培養基1∶8比例稀釋液化的Matrigel，取100 μl加入上層Transwell小室，固化，以下步驟同遷移實驗。

1.2.6雙熒光素酶報告系統實驗 根據1.2.2進行J82細胞培養和轉染，將構建的含HOXA11-AS和miR-515-5p結合位點的WT-HOXA11-AS和MUT-HOXA11-AS雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-515-5p共轉染J82細胞，轉染后培養48 h，收集并裂解細胞，離心收集上清，-20℃保存或根據試劑盒說明書進行操作，發光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 收集各組轉染的J82細胞，RIPA裂解液裂解細胞，將細胞進行破碎，收集蛋白，并進行SDS-PAGE，分離蛋白，轉PVDF膜，室溫封閉2 h，洗膜，加入稀釋的一抗(Cyclin D1抗體1∶2 000、p21抗體1∶2 000、p27抗體1∶1 000、MMP-2抗體1∶1 000、MMP-9抗體1∶1 000、MMP-14抗體1∶2 000和GAPDH抗體1∶3 000)，4℃過夜孵育，洗膜，加入稀釋的酶標二抗，洗膜，顯影，以為GAPDH內參照，計算蛋白水平。

2 結果

2.1lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC中的表達 結果表明，與正常癌旁組織相比，BUC中HOXA11-AS含量顯著升高(P<0.05)，miR-515-5p的含量顯著下降(P<0.05)，見表1。

2.2干擾HOXA11-AS表達可抑制膀胱尿路上皮癌J82細胞增殖 轉染后，與si-NC組相比，si-HOX-A11-AS組的J82細胞中HOXA11-AS水平顯著下降(P<0.05)，si-HOXA11-AS組的細胞OD值在48 h、72 h均顯著下降(P<0.05)，Cyclin D1表達下降(P<0.05)，p21和p27表達升高(P<0.05)，見圖1和表2。說明干擾HOXA11-AS表達可以抑制J82細胞增殖。

2.3干擾HOXA11-AS表達可抑制膀胱尿路上皮癌J82細胞遷移、侵襲 與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組J82細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著下降(P<0.05)，MMP-2、MMP-9和MMP-14含量顯著降低(P<0.05)，見圖2和表3。

2.4miR-515-5p過表達可抑制J82細胞增殖、遷移、侵襲 轉染后，與miR-NC組相比，miR-515-5p組的miR-515-5p水平顯著上升(P<0.05)，J82細胞OD值在48 h和72 h時均顯著降低(P<0.05)，遷移細胞數和侵襲細胞數也顯著下降(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達降低(P<0.05)，p21表達升高(P<0.05)，見圖3和表4。

表1 HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC和癌旁組織中的表達

圖1 增殖相關蛋白表達Fig.1 Expression of proliferation-related proteins

表2 干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖的影響

圖2 干擾HOXA11-AS表達對J82細胞遷移、侵襲的影響

圖3 miR-515-5p過表達對J82細胞增殖、遷移侵襲的影響

表3 抑制HOXA11-AS表達對J82細胞遷移、侵襲的影響

表4 miR-515-5p過表達對J82細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 HOXA11-AS的序列中含有與miR-515-5p互補的核苷酸序列Fig.4 Sequence of HOXA11-AS contains complementary nucleotide sequences with miR-515-5p

2.5lncRNA HOXA11-AS靶向調控miR-515-5p的表達 Targetscan預測發現，miR-515-5p的序列中含有與HOXA11-AS互補的序列，見圖4。雙熒光素酶報告系統結果如表5所示，與miR-NC對照組相比，miR-515-5p組野生型WT-HOXA11-AS的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而突變型MUT-HOXA11-AS的螢火蟲熒光素酶相對活性無顯著性差異。qRT-PCR結果表明，與pcDNA組相比，pcDNA-HOXA11-AS組的miR-515-5p含量顯著下降(P<0.05)；與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組的miR-515-5p水平顯著上升(P<0.05)。說明HOXA11-AS靶向負調控miR-515-5p的表達，見表6。

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 lncRNA HOXA11-AS調控miR-515-5p的表達

圖5 抑制miR-515-5p表達逆轉干擾HOXA11-AS表達對膀胱尿路上皮癌J82細胞增殖、遷移侵襲的作用

表7 抑制miR-515-5p表達逆轉干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移、侵襲的作用

2.6抑制miR-515-5p表達逆轉干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組J82細胞中miR-515-5p含量顯著升高(P<0.05)，細胞OD值在48 h和72 h時顯著下降(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數下降(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達降低(P<0.05)，p21表達升高(P<0.05)；與si-HOXA11-AS+anti-miR-NC相比，si-HOXA11-AS+anti-miR-515-5p組J82細胞結果相反，見圖5、表7。說明抑制miR-515-5p表達逆轉干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

3 討論

HOXA11-AS是一種新發現的致癌lncRNA，在多種腫瘤中表達上調，是一種可預測惡性腫瘤轉移和預后的潛在生物標志物[10]。 HOXA11-AS在胃癌組織中表達上調，在體內敲除HOXA11-AS可誘導胃癌細胞G0/G1期阻滯，抑制胃癌細胞的遷移、侵襲和轉移[11]。HOXA11-AS在乳腺癌組織中高表達，通過影響EMT標志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達，干擾其表達可抑制癌細胞侵襲和遷移[12]。HOXA11-AS在膠質瘤組織和細胞中表達升高，通過調控miR-214-3p/EZH2軸促進膠質瘤細胞生長和轉移[13]。但其在BUC中的表達還不清楚。本研究發現，與正常癌旁組織相比，HOXA11-AS在BUC組織中表達量顯著升高，干擾HOXA11-AS表達可抑制膀胱尿路上皮癌J82細胞增殖、遷移、侵襲。HOXA11-AS在多種癌癥包括BUC中表達上調，并調控癌細胞增殖、遷移和侵襲[10]。

本研究通過Targetscan預測發現，lncRNA HOXA11-AS序列中含有與miR-515-5p互補的核苷酸序列，預示miR-515-5p可能是HOXA11-AS的靶基因。miR-515-5p在前列腺癌、非小細胞肺癌和胃癌中表達下調，與癌細胞的增殖和轉移有關[7-9]。miR-515-5p在乳腺癌組織中表達下調，與IGF-1R的單核苷酸多態性影響BRCA1突變攜帶者的乳腺癌風險[14]。miR-515-5p高表達與乳腺癌和肺癌患者生存率增加有關，通過miR-515-5p/MARK4途徑調控癌細胞的遷移和侵襲[15]。miR-515-5p在BUC中的表達尚不清楚。本研究結果發現，miR-515-5p在BUC組織中水平降低，過表達miR-515-5p可抑制J82細胞增殖、遷移、侵襲。說明miR-515-5p在BUC進展中發揮重要作用。

而雙熒光素酶報告系統和qRT-PCR結果顯示，HOXA11-AS靶向負調控miR-515-5p的表達；抑制miR-515-5p表達逆轉了干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移、侵襲的作用，進一步證實了在BUC中兩者的調控關系。綜上，本研究闡述了在BUC細胞J82中，lncRNA HOXA11-AS靶向miR-515-5p調控腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究只進行了體外細胞的研究，后續研究會從體內動物模型試驗著手，以期為BUC的臨床研究提供更多的數據支持，以期發現新的靶點。