鈣敏感受體在胰島素抵抗狀態下腎動脈平滑肌細胞增殖和遷移中的作用

李光偉，李 波，金 莉，邱麗萍，張亞珍，吳淑琴

(齊齊哈爾醫學院 1. 病理生理學教研室、2.機能實驗教學中心、3.病理學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是危害人類健康的常見的慢性代謝性疾病，發病率逐年提高，我國是DM患者最多的國家之一，DM血管病變是其致死致殘的主要原因[1-2]。DM血管病變的重要特點是動脈粥樣硬化，動脈平滑肌細胞增生和遷移是其發生的原因之一。DM血管病變以及血管平滑肌功能紊亂是多因子參與的復雜網絡調控過程[3]。研究表明[4]，鈣離子和鈣信號轉導在動脈中膜平滑肌細胞表型改變以及增生、遷移過程中發揮重要作用。

鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)是一種G蛋白偶聯受體，在細胞分泌、增殖、分化、趨化、凋亡等過程中發揮重要作用[5]。近年來，越來越多的研究顯示，心血管系統中有CaSR的全長表達，并在血管收縮與動脈粥樣硬化等生理及病理過程中發揮調節功能[6]。但是CaSR在糖尿病腎動脈硬化中的作用尚無報道。根據文獻調研與前期預實驗情況，我們推測：CaSR可能參與糖尿病腎動脈平滑肌細胞(renal artery smooth muscle cell，RAMSC)增生及遷移的發展過程。為證明此假說，我們做如下研究，以期為糖尿病腎動脈硬化的臨床治療提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康Wistar大鼠，體質量(200±20)g，♂，SPF級。由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供。動物許可證號：SYXK(黑)2008004。

1.1.2主要試劑 CaSR抗體(sc-47741，Santa)；PCNA抗體(sc-25280，Santa)；MMP-2抗體(sc-13595，Santa)；α-SMA抗體(BM0002，博士德)；NPS2143(sc-361280A，Santa)；GdCl3(sc-224004，Santa)；胰島素(CI6561，coolader)；細胞周期試劑盒(G019，南京建成)；MMP-2 ELISA檢測試劑盒(H146-1，南京建成)；Transwell小室(3422，corning)；DAB顯色試劑盒(AR1022，博士德)；即用型SABC試劑盒(SA1025，博士德)。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡(Olympus)；DF-D 型恒壓恒流電泳儀(北京六一廠) ；高速離心機(Sigma)；化學發光成像系統(上海天能)；流式細胞儀(Becton Dickinson)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1大鼠腎動脈平滑肌細胞的原代培養 wistar大鼠處死，無菌條件下迅速取腎動脈，冷 PBS 漂洗，剔掉多余組織。縱向剖開，輕刮內膜。中膜在冷 PBS 中漂洗，切成約 1 mm2組織塊，均勻貼于培養瓶底部，將培養瓶翻轉置于培養箱中 5-6 h，加入20%胎牛血清的DMEM 培養基，將培養瓶翻轉過來，靜置培養。

1.2.2大鼠腎動脈平滑肌細胞鑒定 細胞丙酮固定，PBS洗；0.5% H2O2稀釋的甲醇室溫20 min，PBS洗；山羊血清室溫20 min；α平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)抗體4 ℃過夜；PBS洗，二抗37 ℃ 30 min，PBS洗；SABC 37 ℃孵育20 min，DAB顯色10 min；自來水沖洗，蘇木精復染，二甲苯透明，封片。

1.2.3實驗分組及模型的復制 成對數生長的RAMSC無血清培養24 h，加入藥物干預，分組如下，對照組：正常細胞培養(含5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養基)，不做任何處理；單純模型組(高糖+高胰島素)：加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰島素(10-7mol·L-1)作用72 h；模型+CaSR激動劑：加入GdCl3(30 μmol·L-1)4 h后，再加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰島素(10-7mol·L-1)作用72h；模型+CaSR抑制劑：加入NPS2143(10 μmol·L-1) 12 h后，再加入葡萄糖25 mmol·L-1，胰島素(10-7mol·L-1)作用72 h。

1.2.4Western blot檢測CaSR、PCNA及MMP-2的蛋白水平 細胞刮下后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，上清液進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，90 mV轉移2 h至硝酸纖維素薄膜，封閉1.5 h；分別加入一抗CaSR、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP-2)(1 ∶500) 4 ℃過夜。洗膜，二抗(1 ∶10 000)孵育1 h，ECL發光，半定量分析 。

1.2.5細胞增殖周期的檢測 各組細胞胰蛋白酶消化后，PBS洗2次，細胞密度為1×106·L-1，離心2 000 r·min-1，5 min，PBS洗，離心同前，加3 mL預冷乙醇固定，4 ℃過夜，離心2 000 r·min-1，5 min，緩沖液洗滌，離心同前，加A液250 μL，室溫孵育10 min，加B液200 μL，室溫孵育10 min，加預冷C液200 μL，室溫避光10 min，上機檢測。

1.2.6Transwell小室法檢測細胞遷移 各組細胞離心，調整細胞濃度1.0×109/L種于上室，下室加入含有10% FBS的完全培養基600 μL，據分組情況向上室內加入不同藥，培養72 h；上室取出后去除未遷移的細胞，PBS洗；甲醇固定上室細胞20 min；PBS洗，風干，0.5%結晶紫染色20 min，PBS洗，風干。將小室倒立，400倍正置顯微鏡下任意選取5個不同的視野，拍照并計數穿膜細胞數量。

1.2.7ELISA法檢測MMP-2含量 取各組細胞培養液，離心1 500 r·min-110 min，取1 mL上清液待測。按ELISA試劑盒說明書操作。各組均進行3個復孔檢測，均值為終質量濃度。分別以標準物的質量濃度及450 nm波長的吸光度值為橫縱坐標，在半對數坐標紙上繪出標準曲線。在坐標曲線上通過樣品A值，查出相應的樣品質量濃度。

1.2.8細胞內鈣離子濃度的檢測 細胞棄培養液，含鈣Krebs溶液沖洗。Fluo-4 AM 37 ℃避光孵育30 min；去除負載液，含鈣Krebs溶液沖洗，備用。在鏡下選取細胞狀態好，質膜完整的細胞進行實驗。用激光掃描共聚焦顯微鏡監測細胞內鈣離子的變化，激發波長為488 nm。

2 結果

2.1 大鼠腎動脈平滑肌細胞鑒定為鑒定提取的原代大鼠RASMC，我們進行抗α-SMA免疫組化染色。結果如Fig 1，胞質染成黃褐色，胞核不著色，胞質中有較多的條絲狀物，與細胞縱軸平行，即為肌動蛋白。計數200個細胞，見10個細胞未染色，平滑肌細胞的純度為95%。

Fig 1 Identification of RASMCs (immunohistochemical staining ×400)

2.2 不同藥物處理對CaSR表達的影響為探究胰島素抵抗對CaSR表達的影響，我們通過Western blot實驗檢測了不同藥物處理后CaSR蛋白的表達情況。結果如Fig 2，與control組比較，HG+HI組CaSR表達增加(P<0.05)；與HG+HI組比較，GdCl3能增加CaSR表達(P<0.05)，CaSR抑制劑NPS2143的作用相反。

Fig 2 Effects of different treatment factors on

2.3 不同藥物處理對PCNA蛋白表達的影響PCNA是反映細胞增殖狀態的良好指標，為觀察CaSR活化對RASMC增殖的影響，我們觀察了不同藥物處理后PCNA蛋白表達的變化。結果顯示(Fig 3)：與control組比較，高糖和高胰島素能夠上調PCNA蛋白表達水平(P<0.05)；在此基礎上GdCl3能夠進一步增加其表達水平(P<0.05)； NPS2143則與GdCl3作用相反。

Fig 3 Effects of different treatment factors on PCNA

2.4 不同藥物處理對細胞周期及細胞增殖指數的影響為進一步探究CaSR活化對RASMC增殖的影響，我們又觀察了不同藥物作用后細胞周期及細胞增殖指數的變化。細胞增殖指數(PI)=(S+G2/M)/ (S+G2/M+G0/G1)。結果顯示：高糖和高胰島素組S和G2/M期細胞數量增多，PI高于對照組(P<0.05)，CaSR激動劑組PI高于HG+HI組(P<0.05)，NPS2143組PI明顯低于HG+HI組(P<0.05)，如Fig 4。

Fig 4 Effects of different treatment factors on cell cycle n=3)

2.5 不同藥物處理對細胞遷移的影響為研究CaSR活化對RASMC遷移的影響，我們做了Transwell小室實驗。結果顯示(Fig 5)：HG+HI組平均每個高倍視野穿過濾膜的細胞數明顯增加(P<0.05與control組比較)，提示高糖和高胰島素可增加RASMC的運動侵襲能力。高糖和高胰島素基礎上NPS2143能抑制細胞遷移，GdCl3能促進其遷移(P<0.05)。

Fig 5 Effects of different treatment factors

2.6 不同藥物處理對MMP-2蛋白表達的影響MMP-2能夠降解細胞外基質，在細胞遷移過程中發揮重要作用，為觀察其在CaSR活化對RASMC遷移中的作用，我們通過Westen blot實驗檢測了不同藥物處理情況下MMP-2蛋白表達的變化。如Fig 6所示，HG+HI組MMP-2蛋白表達增加(P<0.05與control組比較)；高糖和高胰島素基礎上GdCl3和NPS2143分別能上調和下調這種作用(P<0.05與HG+HI組比較)。

2.7 不同藥物處理對細胞分泌MMP-2的影響為觀察MMP-2在CaSR活化對 RASMC遷移中的作用，我們又檢測了細胞上清液中的MMP-2含量。如Fig 7，HG+HI組細胞上清液中的MMP-2蛋白含量高于對照組(P<0.05)，但卻明顯低于HG+Gd組(P<0.05)，NPS2143則與GdCl3作用相反。

2.8 不同藥物處理對細胞內鈣離子濃度的影響為揭示CaSR活化促進RASMC增殖和遷移的機制，我們檢測了不同藥物處理后細胞內鈣離子濃度的變化。在HG+HI組細胞內鈣濃度增加(P<0.05與control組比較)，HG+Gd組細胞內鈣離子濃度進一步上升(P<0.05與HG+HI組比較)，HG+NPS組鈣離子濃度下降(P<0.05與HG+HI組比較),如Fig 8所示。

Fig 6 Effects of different treatment factors on

Fig 7 Effects of different treatment factors on secretion of MMP-2 by RASMCs n=3)

3 討論

近年來，DM已成為威脅人類生命健康的“甜蜜殺手”，我國是DM患者最多的國家之一。作為慢性代謝性疾病DM有多種并發癥：嚴重代謝紊亂、感染性疾病、血管的病變及糖尿病足等，其中血管病變是DM致死致殘的主要原因[3]。DM大血管病變的臨床特點是血管功能及結構異常，包括動脈硬化斑塊形成、血管僵硬度增加等。與其他血管損傷不同的是DM血管病變內環境紊亂更加復雜，高血糖、胰島素抵抗及脂代謝紊亂等導致內皮細胞更易損傷。失去內皮保護的中膜平滑肌細胞暴露于多重刺激下,發生增殖、遷移并合成大量的細胞外基質，沉積于血管壁[7]。研究表明[4]，鈣離子和鈣信號轉導在動脈中膜平滑肌細胞表型改變以及增生、遷移過程中發揮重要作用。

Fig 8 Effects of different treatment factors on calcium ion concentration n=3)

鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)是一種G蛋白偶聯受體，參與體內很多重要的病理生理過程。近年來，CaSR在心血管系統中的功能及其在代謝性疾病，如高血壓、肺動脈高壓及糖尿病性心肌病變等中的作用正在被逐步揭示[8-10]。有學者研究發現CaSR在動脈粥樣硬化大鼠血管內皮細胞以及氣道平滑肌細胞中有表達,其活化影響細胞的增殖和遷移[11-12]。盡管CaSR 與動脈粥樣硬化關系密切，但其在DM血管病變中的作用卻鮮有報道。

高血糖及胰島素抵抗是DM患者的重要內環境特征，也是引起機體出現各種病理改變的基礎。Malecki等[13]發現DM患者單核細胞CaSR表達增多，并依賴于空腹血糖濃度。Lu等[14]研究證實高糖促進大鼠主動脈內皮細胞CaSR的表達，并可能參與內皮細胞凋亡過程。本研究結果顯示：大鼠RASMC中存在CaSR蛋白的表達，高糖和胰島素能使其表達增加，CaSR激動劑上調此作用，抑制劑則相反，提示胰島素抵抗能夠活化大鼠RASMC的CaSR。

平滑肌細胞增殖是動脈硬化的重要原因，Zhu等[15]研究表明，在CaSR shRNA大鼠，吸煙引起的肺動脈增生明顯減弱。新近研究揭示缺氧活化的CaSR促進人肺動脈平滑肌細胞增殖和表型轉化，進而促進肺動脈高壓的發生和發展[4]。我們的結果亦顯示高糖和胰島素能促進RASMC增殖。這些作用能夠被CaSR激動劑GdCl3所增強，被其抑制劑所減弱，提示胰島素抵抗活化的CaSR參與了RASMC的增殖過程，是導致DM患者發生腎動脈硬化的原因之一。

血管平滑肌細胞遷移和表型改變是導致DM血管損傷的重要因素。Brennan等[16]研究表明活化的CaSR能夠促進腫瘤細胞轉移，比如乳腺癌、前列腺癌等。本研究結果提示：胰島素抵抗活化的CaSR促進RASMC遷移過程。血管平滑肌細胞遷移受很多因素的影響，MMP是一類能夠降解細胞外基質的蛋白酶家族，通過改變細胞和基質的結合特性協助細胞遷移，在腫瘤細胞的浸潤、轉移中起促進作用。MMP-2是血管平滑肌細胞中表達的一種重要的MMP，能水解Ⅳ型膠原，是細胞穿越基底膜過程的重要物質。本實驗結果提示，胰島素抵抗活化的CaSR通過增加MMP-2蛋白的表達，增強其降解細胞外基質作用進而促進細胞遷移的進程。

同時，我們觀察到細胞內鈣離子濃度隨著細胞增殖及遷移的程度而同步變化，鈣離子濃度升高，細胞的增殖及遷移指標相應上調，而鈣離子濃度下降后，細胞增殖及遷移指標也隨之相應下調。Lu等[17]報道：在缺氧條件下CaSR通過IP3受體導致鈣離子從肌漿網釋放，進而促進心肌細胞凋亡。本實驗結果提示：在胰島素抵抗活化的CaSR所介導RASMC增殖及遷移的過程中，鈣離子也起到了類似的中繼作用，并且促進了細胞的增殖與遷移。

綜上，胰島素抵抗活化的CaSR促進RASMC的增殖與遷移過程，進而參與DM腎血管硬化的形成，且鈣離子在此過程中扮演了重要的角色。本研究為DM腎動脈硬化的臨床治療提供了新思路與新視角。但由于本研究為體外細胞實驗，尚未建立動物模型驗證，另外細胞內鈣離子濃度增加通過哪些具體分子機制促進RASMC的增殖和遷移，這些問題仍有待后續研究。