膠體金法檢測SARS-CoV-2總抗體的檢測性能評價與探討

陶 然，莫南勛，李 玲，李慧源，李根石，鄧小燕，陳建波,4，何 君,5，程雅婷,5，周 妍，謝 文，張 玲,6△

1.廣州金域醫(yī)學檢驗中心，廣東廣州，510005；2.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣東廣州 510006；3.武漢金域醫(yī)學檢驗所，湖北武漢 430100；4.國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心病毒診斷研究分中心，湖北武漢 430100；5.國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心病毒診斷研究中心，廣東廣州 510005；6.武漢雷神山醫(yī)院，湖北武漢 430200；7.上海市第一人民醫(yī)院，上海 200003；8.武漢大學中南醫(yī)院，湖北武漢 430071

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染人體后可引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[1]，該病毒傳播途徑多樣，潛伏期長且人群普遍易感[2]。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》[3]，首次將抗體檢測結(jié)果作為血清學證據(jù)，納入COVID-19確診指標；同時，聯(lián)合兩次核酸檢測結(jié)果可作為疑似病例的排除標準。目前，檢測抗體的方法主要有膠體金法和化學發(fā)光法，檢測物質(zhì)有總抗體(包括IgM、IgG、IgA等SARS-CoV-2的特異性抗體)、IgM、IgG。診療方案中提出可通過IgM和IgG的陰陽性或檢測值的變化進行診斷。由于膠體金法可快速檢測總抗體，縮短診斷窗口期，聯(lián)合核酸檢測，還能提升SARS-CoV-2檢出率，防止漏檢；同時，具有方便、快捷的優(yōu)勢，在部分場合下可快速定位疑似人群、迅速隔離、防止傳播[4]。通過發(fā)病7 d后抗體血清學檢測結(jié)果，聯(lián)合兩次核酸檢測結(jié)果，提高排除疑似病例的準確性，合理節(jié)約醫(yī)療資源。本文通過對COVID-19人群、其他病原體感染人群的總抗體進行檢測，評估其臨床性能，為后續(xù)應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年2—3月在武漢雷神山COVID-19隔離觀察病房住院的患者血清標本共計89例(COVID-19組)，其中，男53例、女36例，年齡24～89歲、中位年齡67歲，40歲以上患者83例(93.2%)。非COVID-19患者88例(非COVID-19組)，其中男48例、女40例，年齡28～95歲、中位年齡65歲。非COVID-19組來自廣州金域醫(yī)學檢驗中心，SARS-CoV-2檢測結(jié)果均為陰性，其中肺炎衣原體IgM陽性4例、肺炎支原體IgM陽性14例、乙型流感病毒IgM陽性8例、副流感病毒IgM陽性6例、Q熱立克次體IgM陽性5例、嗜肺軍團菌IgM陽性1例、呼吸道腺病毒IgM陽性1例、呼吸道合胞病毒IgM陽性11例。COVID-19患者排除及納入均依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[4]，普通型、重型、危重型均按該方案分類，病程9～43 d，中位數(shù)26 d。

1.2儀器與試劑 核酸提取及檢測試劑盒購自長沙圣湘生物科技股份有限公司；ABI7500實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；總抗體檢測試劑盒購自廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司。

1.3方法 檢測COVID-19患者、非COVID-19人群總抗體，COVID-19患者入院時、抗體檢測時進行核酸檢測，非COVID-19人群檢測總抗體時行核酸檢測。經(jīng)培訓合格的采樣人員采集所有研究對象鼻咽拭子，采集完成后冷藏送至武漢金域醫(yī)學檢驗所病毒診斷研究分中心實驗室，采用磁珠法提取核酸，實時熒光RT-PCR檢測核衣殼基因(N基因)和開放讀碼框1ab基因(ORF1ab基因)，按廠家說明報告結(jié)果。總抗體檢測：待測標本、試劑平衡至室溫后，向測試卡的加樣孔加入10 μL血清標本，再向測試卡的稀釋液加樣孔加入2～3滴標本稀釋液，15 min后判讀結(jié)果：檢測區(qū)和質(zhì)控各出現(xiàn)一條紅線為陽性，僅在質(zhì)控出現(xiàn)一條紅線為陰性，質(zhì)控區(qū)無紅色線出現(xiàn)，檢測無效。

1.4評價指標 分析兩組患者的抗體結(jié)果。依據(jù)COVID-19患者臨床分型、發(fā)病時間進行分組，比較各組間抗體陽性率。根據(jù)入院核酸檢測結(jié)果和抗體檢測時同期核酸檢測結(jié)果分組，統(tǒng)計各組總抗體檢測結(jié)果的陽性率差異。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；影響因素的分析使用非條件Logistic回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1COVID-19患者核酸檢測結(jié)果 89例COVID-19患者入院核酸檢測陽性35例(39.3%)，其中28例患者住院期間核酸檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陰，7例患者住院期間核酸檢測結(jié)果持續(xù)陽性。

2.2兩組患者總抗體檢測情況 89例COVID-19患者中，77例總抗體檢測結(jié)果陽性，12例抗體檢測結(jié)果陰性；88例非COVID-19患者總抗體檢測結(jié)果均為陰性。8例COVID-19患者總抗體、核酸檢測均為陽性。12例總抗體檢測結(jié)果為陰性的COVID-19患者年齡24～85歲，中位年齡65歲，入院時采集核酸時以及采集總抗體時，核酸檢測均為陰性。男性患者總抗體陽性率為84.9%(45/53)，女性患者總抗體陽性率為88.9%(32/36)，不同性別間總抗體陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。未見8種呼吸道病原體與SARS-CoV-2總抗體的交叉反應。綜合以上檢測結(jié)果，總抗體檢測的靈敏度為86.5%(95%CI：0.793～0.938)，特異度為100.0%，陽性預測值為100%，陰性預測值為80.0%(95%CI：0.696～0.904)，約登指數(shù)為0.865。COVID-19患者和非COVID-19患者的總抗體陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3不同臨床分型的COVID-19患者總抗體陽性率的比較 COVID-19患者中普通型、重型和危重型患者分別有64例(71.9%)、19例(21.3%)、6例(6.8%)，總抗體檢測陽性的患者分別有57例(89.1%)、15例(78.9%)、5例(83.3%)，不同臨床分型的患者總抗體陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。發(fā)病時間為≤14 d、>14～28 d、>28 d的患者分別有10例(11.2%)、45例(50.6%)、34例(38.2%)。不同發(fā)病時間的患者總抗體陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。12例總抗體檢測陰性的COVID-19患者中普通型7例、重型4例、危重型1例。見表1。

表1 不同發(fā)病時間的普通型、重型、危重型患者總抗體陽性情況[n/n(%)]

2.4不同核酸檢測情況患者總抗體陽性情況 根據(jù)入院時和入院后核酸檢測結(jié)果，分為持續(xù)陽性組(入院時核酸檢測陽性，入院后核酸檢測陽性)、陰轉(zhuǎn)陽性組(入院時核酸檢測陰性，入院后核酸檢測陽性)、陽轉(zhuǎn)陰性組(入院時核酸檢測陽性，入院后核酸檢測陰性)、持續(xù)陰性組(入院時核酸檢測陰性，入院后核酸檢測陰性)。4組的總抗體陽性率分別為100.0%(7/7)、100.0%(28/28)、100.0%(1/1)、77.4%(41/53)。持續(xù)陰性組總抗體陽性率與其他組總抗體陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》發(fā)布之前，COVID-19及其疑似人群的確診和排除多采用RT-PCR檢測核酸或進行病毒基因測序，且把連續(xù)兩次核酸檢測陰性(至少間隔1 d)作為解除隔離和出院標準。由于病毒在采樣、送檢、試劑等方面的因素可能導致結(jié)果假陰性[5-6]，本文89例患者入院核酸檢測結(jié)果陽性率僅為60.7%。

目前經(jīng)國家批準的用于檢測SARS-CoV-2抗體的方法主要有膠體金法和化學發(fā)光法。膠體金法相比于化學發(fā)光法檢測更為方便、快捷，不受檢測通量和采樣限制。

本研究納入的COVID-19患者臨床分型均為普通型及以上，發(fā)病到抗體檢測時間中位數(shù)為26 d，根據(jù)相關研究報道，COVID-19患者感染7 d后產(chǎn)生針對病毒的IgM抗體，約14 d產(chǎn)生IgG抗體[7-8]，故本文COVID-19組患者體內(nèi)應以IgG為主。同時，本研究結(jié)果顯示，抗體檢測的總靈敏度和特異度與廠家聲明幾乎一致(廠家靈敏度為86.43%，95%CI：82.51%～89.58%；特異度為99.57%，95%CI：97.63%～99.92%)。

由于膠體金法受抗體結(jié)合位點、判讀方式所限，靈敏度不及化學發(fā)光法，李萍等[9]研究結(jié)果顯示，化學發(fā)光法檢測IgG和IgM的靈敏度分別為90.5%、75.9%，檢測IgG的靈敏度高于膠體金法。但本研究檢測的總抗體采用包含抗μ鏈抗體和抗人IgG抗體的二抗，其聯(lián)合檢測靈敏度高于單獨抗體檢測，可使處于不同潛伏期的患者以及體內(nèi)存在不同抗體成分的人群得以檢出；另一方面，LI等[10]研究顯示，IgM抗體在生成2周左右開始衰減，若僅測定IgM抗體，有可能在低于檢測限后出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這時IgG抗體大量分泌，通過抗體聯(lián)合檢測可有效降低假陰性率。另外，所有非COVID-19患者均未檢測出總抗體，特異性表現(xiàn)良好。基于以上特點，膠體金法測定SARS-CoV-2總抗體聯(lián)合核酸檢測可適用于社區(qū)診所、公司、學校、機場、海關等地快速定位疑似人群。

89例COVID-19患者中12例患者總抗體為陰性，且均存在持續(xù)陰性組中，持續(xù)陰性組抗體陽性率與其他組陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他3組抗體陽性率均為100.0%。結(jié)合臨床資料，推測原因可能如下：(1)由于臨床治療及病程偏長，SARS-CoV-2的IgG抗體存在不同程度的降解并低于試劑檢出限；(2)12例患者中9例(75%)為65歲以上，免疫功能相對較低，或接受免疫抑制劑治療，抗體產(chǎn)生不足或抗體產(chǎn)生所需時間更長，低于試劑檢出限；(3)存在病毒其他分型或基因變異，導致抗體與試劑重組抗原的結(jié)合受到影響，以至兩個血清學檢測試劑及基因檢測試劑均未能檢出；(5)核酸檢測的假陰性。另外，本研究結(jié)果顯示，不同臨床分型和發(fā)病時間的患者其總抗體陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明總抗體檢測結(jié)果與臨床分型和發(fā)病時間均無明顯相關性，提示治療過程中宜基于不同目的分別進行IgG和IgM的檢測。最后，基于抗原檢測特點，不同品牌試劑重組抗原選擇的蛋白靶點和片段、抗原表達及純化效果、整體工藝的差異可能會導致極少部分COVID-19患者結(jié)果的差異。另外，對多次核酸陰性、臨床癥狀明顯且總抗體陰性的患者，建議使用化學發(fā)光法檢測總抗體。

SARS-CoV-2總抗體檢測雖然也存在局限，但結(jié)合核酸檢測，有利于疫情的控制。文本的局限性在于COVID-19組均為普通型及以上，若增加輕型、SARS-CoV-2無癥狀感染者的評估，總抗體的檢測效能評估將會趨于完善。綜上所述，對COVID-19患者總抗體檢測方便快捷，且有助于疑似人群中感染者的快速定位，有利于疫情的控制。