窖泥微生物群落結構的差異性對豫坡基酒品質的影響

郭 瑩，惠 明*，田 青，黃繼紅，王洪照

1.河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001 2.河南豫坡酒業有限責任公司，河南 駐馬店 463900

以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒在我國銷量最大，因其具有香味濃郁、口味醇厚的特征而備受許多消費者青睞[1]。醇、酸、醛、酯是白酒的呈香呈味物質，僅占總量的2%左右，各成分的比例決定著白酒的質量和風格。常說“老窖產好酒”，不同窖齡窖池會產不同品質的白酒，但是實際生產中發現相同窖齡、相同原料、相同發酵蒸餾工藝的不同窖池也會產生不同品質的白酒。窖泥是濃香型白酒發酵的基礎，窖泥中微生物菌群質量對酒的質量有決定性的影響[2]。研究窖泥微生物方法包括純培養的傳統方法及TA克隆文庫[3]、磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA[4])、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE[5])、熒光原位雜交(fluorescence in situhybridization，FISH[6])等現代分子生物學方法。相比以上方法，第2代高通量測序技術具有明顯優勢，可產生大量數據、準確率高，可在“屬”水平上全面揭示環境中微生物群落信息[7]。趙東等[8]通過高通量測序技術分析了不同窖泥中原核微生物的多樣性及豐度，揭示了己酸菌群和甲烷菌群對濃香型酒風味品質的影響。該研究是豫酒振興計劃項目的一部分，作者以地方特色酒“豫坡老基酒”為對象，分析窖泥微生物組成對白酒風味品質的影響，為企業酒質提升和維持穩定提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2個相同窖齡、相同原料、相同生產工藝的窖池所產的基酒及對應窖池的窖泥：河南豫坡酒業有限責任公司。窖齡均為50 a，窖泥編號分別為LB和HA。窖泥取樣采用5點取樣法[9]。

氯化鈉：分析純，天津市天力化學試劑有限公司；FastDNA? SPIN Kit for Soil：MP Biomedicals生物醫學公司；瓊脂糖：Biowest公司；FastPfu Polymerase：TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：Axygen公司；建庫試劑盒：Bioo Scientific；測序試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 主要儀器與設備

Agilent 7890 A-5975C GC/MS氣相色譜質譜聯用儀和20 mL頂空進樣瓶：美國Agilent公司；固相微萃取裝置(SPME手柄、65 μm PDMS/DVB萃取頭)：西格瑪奧德里奇公司； DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；ABI GeneAmp? 9700型PCR儀：北京賽百奧科技有限公司；Miseq高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基酒揮發性成分的檢測

基酒中揮發性成分的測定采用HS-SPME-GC-MS[10]。

1.3.2 DNA提取

用FastDNA? SPIN Kit for Soil快速提取試劑盒提取窖泥中微生物基因組 DNA，-20 ℃保存。

1.3.3 PCR擴增及高通量測序

提取基因組DNA作為模板，采用細菌16S V3-V4可變區的引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，古菌的16S V4-V5可變區的引物524F10extF(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)和Arch958RmodR(5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)，真菌的18S V5-V7可變區的引物SSU0817F(5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’)和1196R(5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’)進行PCR擴增。PCR擴增條件參考楊小麗等[11]的方法。PCR擴增后產物純化回收，由上海美吉生物醫藥科技有限公司通過Illumina Miseq平臺進行高通量測序。基于上海美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com)進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 基酒中主要揮發性成分的GC-MS分析

對兩個相同窖齡、相同原料、相同工藝窖池所產基酒進行揮發性成分 GC-MS 檢測，用面積歸一化法得出基酒中主要揮發性成分相對含量，相對含量>1%的揮發性成分見表1。

酒質的差異實際上是白酒中呈香物質組成的差異。從表1可以看出，HA基酒中相對含量大于1%的揮發性成分中酯的種類更豐富，且己酸乙酯的相對含量較高，濃香型風格更突出，品質較好。生產LB基酒、HA基酒的兩個窖池窖齡相同，生產中所用的原料、發酵蒸餾工藝也相同，但產出的基酒品質不同，根本原因是釀酒微生物群落組成差異[12]。窖泥是濃香型白酒發酵的基礎，為了解影響基酒品質的根本原因，需進一步分析窖泥中微生物菌群結構。

表1 基酒中主要揮發性成分及相對含量Table 1 Main volatile components and their relative content of base wine

2.2 窖泥細菌多樣性分析

對LB和HA窖泥細菌的16S rDNA V3-V4區進行高通量測序，經統計，窖泥樣品讀取的序列數分別為46 690和69 512，抽平后被利用上的序列數均為38 463，序列平均長度分別為 418.24 bp和410.28 bp。樣品Shannon 指數(2.92、3.53)、Chao指數(387.63、427.71)和Shannoneven指數(0.50、0.60)均表現為HA窖泥高于LB窖泥，說明HA窖泥細菌群落有更高的物種多樣性、群落豐富度及群落均勻度。Coverage指數分別為99.83%和99.82%，Coverage指數表明測序已覆蓋到樣品中幾乎所有的物種，本次測序結果可以代表樣品中微生物真實情況。

2.3 窖泥細菌群落結構組成分析

根據16S高通量測序的序列數據，這2個窖泥樣品中細菌主要分布在 9個門、19個綱、41個目、85個科和 176個屬。在門水平上，LB窖泥物種隸屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)(70.05%)、厚壁菌門(Firmicutes)(28.77%)和其他門。HA窖泥物種隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)(72.17%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(27.11%)和其他門。厚壁菌門(Firmicutes)在HA窖泥中豐度較大，擬桿菌門(Bacteroidetes)在LB窖泥中豐度較大。窖泥樣品中平均相對含量>1.0%的細菌門如圖1a所示。

在屬水平上，LB窖泥中主要的優勢物種為產乙酸嗜蛋白菌屬(Proteiniphilum)(57.53%)、氫孢菌屬(Hydrogenispora)(7.98%)、沉積菌屬(Sedimentibacter)(4.11%)、產己酸菌屬(Caproiciproducens)(0.97%)、Clostridium_sensu_stricto_12(2.13%)、norank_f_Marinilabiliaceae(7.89%)、三角菌屬(Petrimonas)(4.34%)、Christensenellaceae_R-7_group(2.87%)。HA窖泥中主要的優勢物種為產乙酸嗜蛋白菌屬(Proteiniphilum)(24.92%)、氫孢菌屬(Hydrogenispora)(28.55%)、沉積菌屬(Sedimentibacter)(6.53%)、產己酸菌屬(Caproiciproducens)(8.41%)、Clostridium_sensu_stricto_12(6.01%)、三角菌屬(Petrimonas)(1.31%)、泰氏菌屬(Tissierella)(2.35%)、互營單胞菌屬(Syntrophomonas)(1.49%)、瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)(1.42%)、norank_f_Clostridiaceae_1(1.63%)、Caldicoprobacter(1.35%)、norank_f_Family_XIV(1.35%)。窖泥中的這些微生物可以產生有機酸、醇類、醛類、氨基酸等白酒中關鍵的風味成分及其前體物質?？梢援a生己酸、丁酸等白酒重要風味物質的產己酸菌屬(Caproiciproducens)和Clostridium_sensu_stricto_12在HA窖泥中豐度更大。根據已知的菌屬的代謝功能，產己酸菌屬(Caproiciproducens[13])和梭菌屬(Clostridium[14-15])可以通過厭氧發酵生成H2、CO2、丁酸和己酸。窖泥樣品中豐度>1.0%的細菌屬如圖1b所示。

圖1 窖泥樣品中細菌門和屬水平的物種組成Fig.1 Composition of bacterial community at the phylum and genus level in pit muds

2.4 窖泥古菌多樣性分析

對LB窖泥和HA窖泥古菌的16S rDNA V4-V5區進行高通量測序，窖泥樣品中讀取序列數分別為57 878和43 723，抽平后最終被利用上的序列數均為35 469，序列平均長度分別為429.80 bp和429.91 bp。樣品Shannon 指數(1.21、0.88)、Chao指數(42.67、18.5)和Shannoneven指數(0.33、0.32)均表現為LB窖泥高于HA窖泥，說明LB窖泥古菌群落有更高的物種多樣性、群落豐富度和群落均勻度。測序深度指數Coverage分別為99.98%和99.99%，Coverage指數表明測序已覆蓋到樣品中幾乎所有的物種，本次測序結果可以代表樣品中微生物真實情況。

2.5 窖泥古菌群落結構組成分析

在2個窖泥樣品中，古菌的微生物群落變化相對簡單，主要分布在 4個門、6個綱、7個目、7個科和 11 個屬。廣古菌門(Euryarchaeota)在LB和HA窖泥中均占絕對優勢，豐度分別為98.59%和99.88%。窖泥樣品中豐度>1.0%的古菌門如圖2a所示。

在屬水平上，LB窖泥中優勢古菌微生物為甲烷桿菌屬(Methanobacterium)(52.35%)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)(40.35%)、甲烷囊菌屬(Methanoculleus)(4.83%)和Methanomassiliicoccus(0.99%)。HA窖泥中優勢古菌微生物為甲烷桿菌屬(Methanobacterium)(69.41%)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)(27.44%)、甲烷囊菌屬(Methanoculleus)(1.84%)和Methanomassiliicoccus(1.10%)。甲烷菌的存在代表著窖泥菌群代謝鏈的完善，是窖泥老熟的標志[16]。甲烷菌可以與產氫氣菌(如梭菌和己酸菌)之間進行氫轉移。甲烷桿菌屬(Methanobacterium)以H2、甲酸鹽、二元醇和CO為電子供體，以還原CO2為CH4作為能量代謝來源。甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)產生CH4的途徑有：裂解乙酸生成CH4,以CO2和H2為原料合成CH4,以各種甲基化合物(甲醇、甲胺、甲基硫化物)為底物生成CH4[17]。窖泥樣品中豐度>1.0%的古菌屬如圖2b所示。

圖2 窖泥樣品古菌門和屬水平物種組成Fig.2 Composition of archaea community at the phylum and genus level in pit muds

2.6 窖泥真菌多樣性分析

對LB和HA窖泥真菌的18S V5-V7區進行高通量測序，經統計，這2個窖泥讀取的序列數分別為59 593和51 429，抽平后得到的序列數均為42 532，序列平均長度分別為381.86 bp和381.11 bp。Shannon指數(0.80、0.86)和Shannoneven指數(0.27、0.32)均表現為HA窖泥大于LB窖泥，說明HA窖泥有更高的群落多樣性和群落均勻度，而Chao指數(20、16)表現為LB窖泥大于HA窖泥，說明LB窖泥有更高的群落豐富度。Coverage指數均大于99.99%，Coverage指數表明測序已覆蓋到樣品中幾乎所有的物種，本次測序結果可以代表樣品中微生物真實情況。

2.7 窖泥真菌群落結構組成分析

這2個窖齡窖泥樣品中真菌主要分布在 9個門，15個綱，19個目，24個科和 26個屬。子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)在LB和HA窖泥中豐度分別為95.38%和55.66%、0.55%和42.54%。纖毛亞門(Ciliophora)在LB窖泥中豐度為2.26%。從圖3可以看出，擔子菌門(Basidiomycota)在HA窖泥中豐度顯著大于LB窖泥，可能是影響產酒品質的重要因素。窖泥樣品中豐度>1.0%的真菌門如圖3a所示。

在屬水平上，LB窖泥優勢物種為unclassified_f_Aspergillaceae(87.70%)、unclassified_f_Trichosporonaceae(0.55%)、unclassified_f_Saccharomycetaceae(2.31%)、毛殼菌屬(Chaetomium)(0.06%)、鐮刀菌屬(Fusarium)(2.62%)、norank_p_Mucoromycota(1.43%)、unclassified_f_Colpodea(2.26%)、Candida-Lodderomyces_clade(1.66%)。HA窖泥優勢物種為unclassified_f_Aspergillaceae(18.16%)、unclassified_f_Trichosporonaceae(38.62%)、unclassified_f_Saccharomycetaceae(12.42%)、毛殼菌屬(Chaetomium)(13.56%)、鐮刀菌屬(Fusarium)(6.19%)、馬拉色菌屬(Malassezia)(3.90%)、枝孢屬(Cladosporium)(2.94%)、norank_p_Mucoromycota(1.04%)、畢赤酵母屬(Pichia)(1.83%)。unclassified_f_Aspergillaceae是LB窖泥中絕對優勢菌屬，豐度為87.70%。從圖3b中也可看到HA窖泥中各菌屬分布更加均勻。窖泥樣品中豐度>1.0%的真菌屬如圖3b所示。

圖3 窖泥樣品真菌門和屬水平物種組成Fig.3 Composition of fungal community at the phylum and genus level in pit muds

3 結論

采用GC-MS分析檢測了河南豫坡酒廠提供的2個相同窖齡、相同原料、相同生產工藝的窖池所產基酒，發現這兩個基酒品質不相同。基于基酒品質的不同，通過Miseq平臺高通量測序技術，分析了這兩個基酒對應窖池窖泥中細菌、古菌及真菌群落多樣性。結果表明，產基酒品質較好的窖泥中細菌和真菌物種分布更加均勻，與白酒香味物質生成有關的Clostridium_sensu_stricto_12和產己酸菌屬(Caproiciproducens)在產基酒品質較好的窖泥中豐度更高。古菌微生物群落結構在兩個窖泥中變化簡單。通過對相同窖齡、相同原料、相同生產工藝但產不同品質基酒的2個窖池窖泥微生物群落結構的差異性分析，證實了窖泥微生物菌群結構是影響基酒質量的根本原因，揭示了“老窖產好酒”的決定因素不是“窖齡”，實質上是有優質質量的菌群結構。因此，為保持基酒品質的穩定，養護窖池、維持窖泥微生物結構的穩定性至關重要。