CD103和E-鈣黏蛋白在結腸癌組織中表達及作用研究①

粟 虹 韓云雪 佐 妍

(桂林醫學院附屬醫院綜合科，桂林 541001)

結直腸癌是全球第四大常見癌癥，其整體5年生存率約為50%[1]。除了腫瘤的病理分期，組織學亞型和外科手術程度外，手術切除的腫瘤組織中腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)的存在也與良好的預后顯著相關[2]。比如CD8+TIL在幾種惡性腫瘤中的積累已被證明與患者良好的預后相關[3,4]。新近報道表明，ITGAE(integrin，alpha E)也稱為CD103，在抗癌免疫中起著至關重要的作用。例如，ITGAE可以通過肺癌和宮頸癌中的細胞毒性T細胞識別異常細胞，殺傷腫瘤細胞[5-7]。上皮組織中的鈣黏蛋白稱為E-鈣黏蛋白，是一種Ca2+依賴的細胞黏著糖蛋白，在維持細胞形態和黏附中發揮重要作用。E-鈣黏蛋白功能異常將導致多種惡性腫瘤的發生發展[8]。本研究檢測了45例結腸癌組織中CD103和E-鈣黏蛋白的表達水平，并在體外實驗探究CD103和E-鈣黏蛋白表達變化對腫瘤活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取2018～2019年于我院進行結腸癌手術的45例標本，均未進行化療和放療。38例正常結腸組織標本中有18例為癌旁組織，并經病理證明為正常組織，20例取自良性疾病結腸部分切除標本。結腸癌45例樣本中男性27例，女性18例。年齡 48～72歲，平均年齡(61.5±6.5)歲。腫瘤分化程度：高中分化21例，低分化24例，伴淋巴轉移19例，無淋巴轉移26例。TNM分期：Ⅰ-Ⅱ期23例，Ⅲ-Ⅳ期22例。兔抗CD103抗體(Sigma)，鼠抗E-cadherin抗體和鼠抗GAPDH抗體(Proteintech)。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(real-time PCR，qRT-PCR) Trizol法提取結腸癌組織中總RNA。使用紫外分光光度計測RNA濃度。根據逆轉錄試劑盒說明，將RNA逆轉錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測結腸癌組織中CD103和E-鈣黏蛋白的表達。所用引物：以 GAPDH 為內參， 上游引物:5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物:5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′；E-鈣黏蛋白引物:上游引物： 5′-TCATGAGTGTCCCCCGGTAT-3′，下游引物：5′-TCTTGAAGCGATTGCCCCAT-3′；CD103引物：上游引物：5′-CAAGAGGTCATCTGCTCATGT-3′，下游引物：5′-GGACAGAACTGCAACGAAGC-3′。

1.2.2腫瘤浸潤淋巴細胞的分離 根據文獻[9,10]中介紹的方法，分離結腸癌組織中浸潤淋巴細胞。無菌操作取得結腸癌組織。PBS清洗結腸癌組織，置于培養皿中，加入8倍體積胰酶消化3 h。剪碎結腸癌組織，并于37℃水浴中孵育1 h，充分消化結腸癌組織，吹打混勻，過濾，收集單細胞懸液于50 ml離心管中，冰上放置10 min。50 g離心2 min。取上清于另一離心管中，400 g離心5 min。棄上清，加入3 ml胰酶重懸沉淀。加入密度梯度離心液，500 g離心20 min，加速9減速4。收集云霧層細胞，加入3 ml胰酶消化液重懸。再加入紅細胞裂解液2 ml，處理5 min，加入2 ml PBS終止孵育，400 g離心5 min，棄上清，得到腫瘤浸潤細胞，PBS洗滌細胞2次，用含10%血清的DMEM重懸細胞進行培養。

1.2.3質粒轉染 TIL在實驗前轉染CD103過表達質粒(CD103 ACT)(Santacruz),轉染了CD103 ACT質粒的TIL細胞記為TIL CD103+，SW480細胞轉染E-鈣黏蛋白敲低質粒(siCDH1)(Invitrogen)記為SW480 siCDH1。

1.2.4體外殺瘤活性測定 將培養的腫瘤浸潤細胞作為效應細胞，SW480作為靶細胞，采用效靶比20∶1在96孔板中混合培養，CCK8檢測SW480細胞存活比率，評價腫瘤浸潤細胞殺傷癌細胞能力。實驗分組：①CD103對TIL腫瘤殺傷活性的影響：SW480與普通TIL共培養(SW480+TIL)，SW480與過表達CD103后的TIL共培養(SW480+TIL CD103+)；②E-鈣黏蛋白對CD103+TIL腫瘤殺傷活性的影響：SW480與普通TIL共培養(SW480+TIL)，SW480與過表達CD103后的TIL共培養(SW480+TIL CD103+)，SW480細胞敲低E-鈣連蛋白后與普通TIL共培養(SW480 siCDH1+TIL)，SW480細胞敲低E-鈣黏蛋白后與過表達CD103后的TILTIL共培養(SW480 siCDH1+TIL CD103+)。細胞存活率=實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值×100%。

1.2.5Transwell體外細胞侵襲實驗 Transwell小室PVDF膜上預先鋪上基質膠，37℃平衡2 h。PBS清洗1遍，放入24孔板內，每孔預先加入600 μl培養基，在Transwell 內室加入400 μl細胞懸液，培養箱中培養12～18 h。用棉簽擦去靠近內室一側的細胞，另一面用甲醛室溫固定30 min，結晶紫染色20 min，PBS洗3遍，顯微鏡下觀察細胞，計數。每組設3復孔。

1.2.6Western blot 收集組織樣本，冰上使用RIPA裂解液裂解組織。BCA法進行蛋白定量，加入上樣緩沖液稀釋并在100℃水浴5 min。采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次15 min，室溫孵育二抗(1∶2 000)2 h，TBST洗滌后用化學發光顯色法顯影，拍照統計。

1.3統計學分析 所有數據采用SPSS11.5軟件包進行分析。各組數據的比較依據資料的性質，采用t檢驗或方差分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1結腸癌組織及正常結腸組織中CD103和E-鈣黏蛋白表達情況 結腸癌組織中CD103與E-鈣黏蛋白的表達情況采用RT-PCR和Western blot檢測，結果如圖1、2所示，與正常組織相比E-鈣黏蛋白在結腸癌組織中表達降低(P<0.001)，CD103 表達增加(P<0.001)。

圖1 結腸癌組織及正常結腸組織中CD103和E-鈣黏蛋白表達情況Fig.1 Expressions of CD103 and E-cadherin in colon cancer tissues and normal colon tissuesNote:Compared with normal tissues,***.P<0.001.

2.2CD103、E-鈣黏蛋白與結腸癌臨床病理特征的關系 結果圖3所示，E-鈣黏蛋白表達與結腸癌有無淋巴結轉移、臨床分期以及分化程度有關，與無淋巴結轉移患者相比，淋巴轉移患者中E-鈣黏蛋白表達更低；臨床分期Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中E-鈣黏蛋白表達更低(P<0.001)。CD103 表達與結腸癌的臨床分期及分化程度有關，在Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中CD103表達更低(P<0.001)；與無淋巴結轉移患者相比，淋巴結轉移患者中CD103表達降低，但沒有統計意義(P>0.05)。

圖3 CD103、E-鈣黏蛋白與結腸癌臨床病理特征關系Fig.3 Correlation of CD103,E-cadherin and clinicopa-thological features of colon cancerNote:Compared with no lymphatic metastasis,ns.P>0.05,***.P<0.001;compared with Ⅰ-Ⅱ stage,*.P<0.05,***.P<0.001;Compared with G1-G2 stage,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3E-鈣黏蛋白對結腸癌細胞侵襲能力的影響 在結腸癌細胞SW480中敲低E-鈣黏蛋白的表達進行Transwell 體外細胞侵襲實驗，E-鈣黏蛋白敲低的SW480細胞(SW480 siCDH1)穿過Transwell 的數目(177±18)明顯高于對照組(SW480)穿過的數目(107±21)。

圖2 Western blot檢測結腸癌組織及正常結腸組織中CD103和E-鈣黏蛋白的表達Fig.2 Expression of CD103 and E-cadherin in colon cancer tissues and normal colon tissues were determined by Western blot

2.4CD103對TIL腫瘤殺傷活性的影響 結腸癌組織中分離出的TIL過表達CD103后，與普通TIL相比，對結腸癌細胞SW480的殺傷活性顯著提高，SW480細胞存活減少(P<0.001)。結果見圖4。

圖4 CD103對TIL腫瘤殺傷活性的影響Fig.4 Effect of CD103 on TIL tumor killing activityNote:Compared with TIL，***.P<0.001.

2.5CD103+TIL依賴E-鈣黏蛋白發揮對結腸癌細胞殺傷作用 結果如圖5，敲低SW480細胞中E-鈣黏蛋白的表達后，TIL以及CD103+TIL對SW480殺傷活性降低，SW480細胞存活增加(P<0.001)；并且TIL和CD103+TIL對E-鈣黏蛋白敲低的SW480細胞(SW480siCDH1)的殺傷活性沒有顯著差異。

圖5 CD103+TIL依賴E-鈣黏蛋白發揮對結腸癌細胞殺傷作用Fig.5 CD103+TIL relies on E-cadherin to kill colon cancer cellsNote:Compared with SW480+TIL,**.P<0.01,***.P<0.001;compared with SW480+TILCD103+,###.P<0.001.

3 討論

CD103是一種介導上皮組織中淋巴細胞保留的整合素，并被認為是腫瘤浸潤淋巴細胞的表面分子標志物[11]。調節性T細胞(Treg)通過與效應T細胞相互調節而維持免疫穩態[12]。然而，Treg細胞在腫瘤微環境中被重新編程，抑制抗惡性腫瘤的免疫反應，從而促進癌癥發展[13]。研究人員發現CD103+TIL比CD103negTIL更強烈地抑制Treg細胞的活化，因此，CD103被認為是選擇性消除腫瘤浸潤性Treg的有趣目標，這種策略可能有助于抗癌療法的改善[11]。本研究結果顯示，與正常組織相比，CD103在結腸癌組織中表達升高，并且與腫瘤的惡性程度有關，在Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中CD103表達更低(P<0.001)，表明隨著病情惡化，CD103+TIL對腫瘤免疫應答的調節能力減弱，這可能是腫瘤惡化的一個原因。另一方面，雖然CD103在伴淋巴結轉移患者中表達降低與無淋巴結轉移患者相比沒有顯著差異，但的確存在降低的趨勢，這可能與樣本例數較少有關。最近的研究表明，CD103+淋巴細胞是結直腸癌微環境的重要組成部分，并與患者生存率呈正相關[14]。此與本研究所得結論一致。

E-鈣黏蛋白是由CDH1基因編碼的一種強有力的黏附分子，負責與鄰近細胞的黏附[15]。現在普遍接受的是，在大多數癌癥的腫瘤進展期間觀察到E-鈣黏蛋白表達的改變，這通常導致腫瘤細胞的侵襲性增加和癌細胞轉移[8,16]。本研究結果顯示，E-鈣黏蛋白在結腸癌組織中表達降低(P<0.001)，并且E-鈣黏蛋白表達與結腸癌有無淋巴結轉移、臨床分期以及分化程度有關，與無淋巴結轉移患者相比，淋巴轉移患者中E-鈣黏蛋白表達更低；臨床分期Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中E-鈣黏蛋白表達更低(P<0.001)。表明隨著結腸癌的惡性程度進展加劇，E-鈣黏蛋白表達降低。體外實驗結果也證實這一結論，敲低SW480細胞中E-鈣黏蛋白表達增加了SW480細胞的侵襲能力，表明E-鈣黏蛋白降低會促進結腸癌的轉移。

研究表明目前CD103的唯一已知配體是E-鈣粘蛋白[17,18]。研究發現黑色素瘤中E-鈣黏蛋白的缺失抑制CD103抗腫瘤活性[19]。然而，尚未研究E-鈣黏蛋白在結腸癌中的表達對CD103+TIL抗腫瘤活性的影響。本研究結果顯示，從結腸癌組織中分離的TIL在過表達CD103后對SW480細胞的殺傷活性顯著增強，而這種殺傷效應在E-鈣黏蛋白敲低后消失。這表明E-鈣黏蛋白的缺失抑制CD103+TIL抗腫瘤活性，主要是由于E-鈣黏蛋白表達降低，與腫瘤浸潤淋巴細胞上的CD103結合減少，導致TIL與癌細胞接觸減少，因此TIL的殺傷活性降低。即使此時增加CD103的表達，但是由于缺乏配體，也難以增加TIL的殺傷活性。CD103+TIL細胞需要與腫瘤細胞接觸并黏附于腫瘤細胞上從而發揮細胞毒性功能。

綜上所述，本研究結果表明CD103和E-鈣黏蛋白在結腸癌的發展及侵襲轉移中發揮重要作用。TIL細胞通過CD103對表達E-鈣黏蛋白的腫瘤細胞進行免疫監視，未來的治療策略可能是尋求擴增CD103免疫細胞亞群，以靶向表達E-鈣黏蛋白的腫瘤細胞。