重癥肌無力患者血漿外泌體microRNA表達譜的初步研究①

李夢夏 徐宏炎 韋敏光 包卓華 徐 肖 劉競麗 李勁頻

(廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，南寧 530021)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG )是一種由乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)介導、細胞免疫依賴、補體參與的累及神經肌肉接頭處傳遞功能障礙的獲得性自身免疫性疾病[1,2]，其發病機制尚未完全闡明。微小核糖核酸(miRNA)是一類平均長度為22個核苷酸(nt)的小分子非編碼RNA，主要在轉錄后對基因表達起調控作用，涉及細胞發育、增殖、分化、凋亡等主要的生物過程[3，4]。研究表明,miRNA可作為多種自身免疫疾病診斷的潛在生物標志物[5]。外泌體是直徑范圍30～100 nm、密度范圍1.13～1.19 g/ml，由細胞釋放到細胞外空間或生物液體中的小膜包裹的微小囊泡，存在于許多生物液體中，包括血液(血清、血漿)、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水、腦脊液、膽汁和細胞上清液等，富含核酸和蛋白質，通過向遠處的組織傳遞信息，介導細胞間的通訊，從而調節細胞的增殖、分化、死亡和免疫反應等[6-9]。外泌體保護miRNA免受血漿RNA酶的侵襲，在不同的儲存條件下，均能保持較好的穩定性，因此，外泌體miRNA可作為疾病潛在的生物標志物[10-12]。目前尚未見MG血漿外泌體miRNA的相關報道，因此我們研究了MG患者血漿外泌體miRNA的差異表達譜，以尋找診斷MG的潛在生物標志物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 收集2017年3月～2017年8月在廣西醫科大學第一附屬醫院門診及住院確診的MG患者8例，MG組納入標準：①隨意肌無力，伴有典型的活動后癥狀加重、休息后減輕或晨輕暮重現象，并且肌疲勞試驗陽性。②新斯的明試驗陽性。③肌電圖呈現低頻重復神經電刺激波幅遞減和(或)單纖維肌電圖顫抖(Jitter)增寬。④血清抗AchR抗體滴度升高。具備上述診斷標準中的①，同時至少具備②～④中的一項，即明確診斷為重癥肌無力。排除標準：排除妊娠期女性以及合并心、肺、肝、腎功能衰竭患者。設立年齡及性別匹配的健康體檢者為對照組。重癥肌無力組中OMG 4例[女∶男=4∶0，年齡(23.0±12.2)歲]，GMG 4例[女∶男=3∶1，年齡(38.5±13.5)歲]；對照組2例[女∶男=1∶1，年齡(30.0±7.1)歲]。用含EDTA的抗凝管收集患者及健康對照者全血5 ml，備用。各組間患者年齡、性別構成比較無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。本研究通過廣西醫科大學第一附屬醫院研究倫理委員會的批準。所有患者及對照者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器 外泌體試劑盒exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit(德國 QIAGEN公司)，透射電子顯微鏡(日本日立集團H7650)，miRNA(v.18.0)基因芯片(廣州市銳博生物科技有限公司)，Genesis軟件。

1.2方法

1.2.1血漿外泌體的分離與鑒定 ①外泌體的提取：取患者或健康對照者全血5 ml，4℃條件下，3 000 r/min離心15 min取上清液，按照說明書利用外泌體試劑盒exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit進行提取；②外泌體的鑒定：透射電鏡法鑒定exosomes：將提取的exosomes做BCA 蛋白定量,用PBS( pH = 7.4 ) 將濃度稀釋為0.5 mg/ml，吸取20 μl 滴到碳膜銅網上，置于紅外燈下5 min至烘干，在碳膜銅網上滴1滴1%磷鎢酸，置于紅外燈下5 min 至烘干，H7650透射電鏡下觀察。

1.2.2不同類型MG患者血漿外泌體源性miRNA表達譜差異的比較分析 采用深度測序聯合芯片技術(由廣州銳博生物科技有限公司完成)，對不同類型(眼肌型、全身型)MG患者血漿外泌體源性miRNA的表達情況進行分析，并與健康對照組比較，統計外泌體源性miRNA在各組之間的相對表達量，篩選出在血漿中表達差異的外泌體源性miRNA，從而獲得不同MG類型相關的血漿候選外泌體源性miRNA。

1.3統計學處理 芯片數據統計學分析應用Edge R軟件，由廣州銳博生物科技有限公司完成；芯片聚類分析應用Genesis軟件。差異表達的標準設為：上調者其log2(Fold change)值>2，下調者其log2(Fold change)值<-2，以P<0.01為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1血漿外泌體分離和鑒定 利用透射電鏡觀察所提血漿外泌體形態，可以看出外泌體呈圓形或類圓形，雙層脂質分子結構，大小分布不均勻，直徑范圍在 30～100 nm(圖1)；流式細胞儀檢測結果顯示：CD63陽性率66.9%，CD81陽性率89.1%(圖2)。上述結果與正常外泌體特點相符。

圖2 流式細胞儀檢測外泌體表面特異性標志CD63和CD81表達水平Fig.2 Exosome surface specific markers CD63 and CD81 expression levels detected by flow cytometryNote:A.Scatter plot；B，C.Unstained negative control；D.CD63 staining；E.CD81 staining.

2.2分析血漿外泌體源性miRNA的表達 采用Genesis分析軟件對差異表達的miRNA進行聚類分析， 結果見圖3A、B。OMG 組與正常對照組比較有顯著差異表達的 miRNA 共4個 (表1) ， 其中1個下調，為hsa-miR-3667-5p，3個上調，上調最顯著的為hsa-miR-3182；GMG組與正常對照組比較有顯著差異表達的miRNA共48個(表2)，其中下調16個，下調最顯著的為hsa-miR-516a-5p，32個上調，上調最顯著的為hsa-miR-1273f。 將OMG、GMG組中的miRNA表達譜進行對比，發現OMG組中差異表達的4個miRNA，在GMG組中均有一致的差異表達。見表1、表2。

表1 OMG組與正常對照組顯著差異表達的血漿外泌體miRNATab.1 Plasma exosomes miRNAs significantly different in OMG group and normal control group

表2 GMG組與正常對照組顯著差異表達的血漿外泌體miRNATab.2 Plasma exosomes miRNAs significantly different in GMG group and normal control group

圖3 聚類分析熱圖Fig.3 Cluster analysis heat mapNote:A.Cluster analysis heat map of OMG group and normal control group；B.Cluster analysis heat map of GMG group and normal control group.In the figure,red indicates that miRNA is up-regulated,and green indicates that miRNA is down-regulated;the small picture above is a chroma key diagram,and different color gradients represent different expression levels.

3 討論

2012年Lin等[13]首次報道了重癥肌無力與miRNA的相關研究，他們分析了MG患者外周血單個核細胞的miRNA表達譜，發現21個過表達的miRNA，其中let-7家族水平顯著降低，并發現其抑制了Jurkat細胞中白介素- 10的表達，從而影響MG發病和進展。重癥肌無力與胸腺異常關系密切，本課題組前期研究了MG患者異常胸腺(胸腺瘤、胸腺增生)與正常胸腺miRNA表達譜的差異，也發現了MG患者胸腺組織中有多個異常表達的miRNA[14]，我們還通過生物信息學方法預測到其中miR-125a-5p的靶基因為Foxp3，并證明了Foxp3基因在Jurkat細胞中的表達受miR-125a-5p調控[15]。此外，我們在伴胸腺增生的MG患者miRNA的研究中，發現miR-548k負調控Jurkat細胞中CXCL13 mRNA的表達[16]。這些研究發現不同的miRNA可能通過調控不同的與免疫相關的靶基因影響MG的發病和進展。

而在一項AchR-Ab陽性MG的研究中，miR-150-5p和miR-21-5p在血清中表達增高，但在使用免疫抑制劑后表達降低[17]。 Zhang等[18]發現使用miR-146a抑制劑沉默miR-146a可有效改善實驗性自身免疫性重癥肌無力小鼠的臨床肌無力癥狀，并且在B細胞中敲除miR-146a后觀察到多種缺陷，包括抗R97-116抗體產生減少，漿細胞、記憶B細胞和B-1細胞數量減少，B細胞活化減弱；因此認為沉默miR-146a可影響B細胞的功能，從而在重癥肌無力的治療中發揮作用。在最新的一項前瞻性研究中，發現miR-30e-5p是從OMG轉化為GMG的風險預測因子之一[19]。這些研究表明，重癥肌無力患者中存在異常表達的miRNA，可能通過調控靶基因的表達而影響疾病的發生發展。

外泌體是miRNA的富集體，有報道稱外泌體攜帶功能性mRNA和能夠在細胞間轉移的miRNA，外周血中的外泌體可能反映了外泌體起源器官的狀態，因此是疾病潛在的生物標志物以及對疾病的治療或進展的預后指標[12，20]。Zhang等[21]發現下丘腦神經干/祖細胞分泌的外泌體miRNA介導了部分抗衰老作用。在不同疾病的研究中，都發現了異常表達的外泌體miRNA，如急性髓性白血病、膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、子癇前期等，這些異常表達的miRNA有望成為輔助疾病診斷和治療的工具[22-26]。

本研究中，我們發現在OMG組中顯著差異表達的miRNA有4個，分別為hsa-miR-3667-5p、hsa-miR-3182、hsa-miR-6843-3p、hsa-miR-1273f；在GMG組中顯著差異表達的miRNA有48個；并且OMG組中顯著差異表達的4個miRNA，在GMG組中均發現了一致的差異表達，說明OMG與GMG可能存在共同的發病機制，也說明這4個差異表達的miRNA與MG的發生有關。其中hsa-miR-3667-5p、hsa-miR-3182在其他疾病的研究中也有相關的報道，例如，Kaur等[27]研究發現了hsa-miR-3667-5p在復雜間日瘧原蟲病中具有顯著的差異表達；在一項研究腎臟疾病miRNA的研究中，發現hsa-miR-3182在IgA腎病患者中顯著下調，此外，hsa-miR-3182在肺腺癌、結直腸癌、多形性膠質母細胞瘤中均發現有差異表達[28-30]；提示當miRNA異常表達時，它們可能導致涉及免疫系統的病理狀態，參與疾病的發生發展，如癌癥和自身免疫性疾病等。而顯著差異表達的hsa-miR-6843-3p、hsa-miR-1273f未見相關報道，我們推測其可能是MG中差異表達的miRNA，通過特定的機制參與MG的發病和進展。我們的研究也是首次對MG患者血漿外泌體miRNA的表達譜進行檢測，下一步將通過體內外模型對這些差異表達的miRNA在MG診斷中的作用進行驗證。

綜上所述，我們在研究中發現了MG患者血漿外泌體中存在多個差異表達的miRNA，提示其在MG疾病的發生發展中可能存在一定的作用，而顯著差異表達的miRNA，特別是hsa-miR-6843-3p和hsa-miR-1273f，可進一步研究其作為診斷MG的潛在生物標志物的可能性。