種子活力或抗老化能力的分子機制研究進展

姜孝成,周詩琪

(湖南師范大學生命科學學院作物不育資源創新與利用湖南省重點實驗室,中國湖南長沙410081)

種質資源(germplasm resources)是生物遺傳信息的載體,是現代種業的核心競爭力和農業科技原始創新的物質基礎,是保障國家糧食、生態及能源安全的重要戰略性資源[1]。為避免種質資源的丟失,有必要對其安全保存[2]。種子是種質資源保存的重要載體,但生理成熟后的種子在貯藏過程中質量會不可逆轉地逐漸下降,這種變化稱為老化或劣變(aging or deterioration)。種子因老化而面對外界脅迫挑戰的脆弱性增加,種子活力降低[3]。種子老化程度因貯藏條件不當特別是高溫高濕條件而不斷加重[4～5]；在此期間,種子內部會發生一系列有害變化,例如種皮機械耐性下降[6]、細胞膜損傷、蛋白質變性、DNA損傷和突變、核酸合成系統破壞等[7～9],最終導致種子活力的喪失。如果種子在貯藏過程中老化或活力下降的問題得不到解決,就會造成種子萌發遲緩、生長勢差、抗逆性弱、生物產量和經濟產量降低,從而影響農業生產。近年來,隨著分子生物學研究技術的發展,特別是高通量測序技術和各種組學技術等的更新換代,在種子活力或抗老化能力方面的分子機制研究取得了顯著進展,本文進行了相關綜述,試圖為進一步利用分子生物學技術手段提高農作物種子活力或抗老化能力,高效保存種質資源提供理論依據。

1 主要農作物種子活力或抗老化能力相關QTLs和候選基因鑒定

生物中大多數可見性狀的遺傳變異是受多基因控制的,這些性狀被稱為數量性狀,控制數量性狀的單個基因座(individual loci)即稱為QTL(quantitative trait loci)。種子活力即是由多基因控制的數量性狀,適合QTL分析[10～15]。QTL分析首先根據某標記基因將待測群體劃分為不同的基因型類別,然后使用相關統計分析來確定某個基因型的個體與其他基因型的個體在所測量的性狀(表型)方面是否存在顯著差異；如果表型顯著不同,即被認為影響該性狀的基因與標記基因連鎖；然后對整個基因組中的其他標記基因重復該分析過程,以檢測出盡可能多的與該性狀連鎖的標記基因。由于無法確定該性狀是否是與標記基因連鎖的一個或多個基因相關,因此創造了數量性狀基因座(QTL)一詞來描述對數量性狀有顯著影響的染色體區域(通常通過與標記基因的連鎖來定義)[16]。確定一個QTL是否由一個或多個基因組成一直是數量遺傳學中最困難的工作之一。近年來,水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)等主要農作物中與種子活力或抗老化相關的QTLs及候選基因鑒定備受關注。

1.1 水稻種子活力或抗老化能力相關QTLs和候選基因鑒定

雜交水稻自1976年開始商業化種植,目前已覆蓋中國水稻總種植面積的50%以上。但雜交水稻種子由于貯藏耐性差或貯藏措施不當而導致種子質量下降,嚴重影響水稻生產的情況時有發生。因此,了解水稻種子活力或抗老化能力的分子機制,培育出種子貯藏耐性好的雜交水稻基因型至關重要[17～18]。Li等[18]使用來自粳稻 CJ06 和秈稻TN1的雜交后代的DH(double haploid)株系群體,在12條染色體上檢測到19個與種子活力相關的QTLs,其中與萌發率相關的QTL qGP9定位在9號染色體(chromosome 9,Chr9)上。幼苗活力是種子活力的表現之一,直接影響水稻的健壯成苗。Xie等[19]使用秈稻珍汕97和明恢63雜交的重組近交系(recombinant inbred lines,RILs)定位了8個與種子活力相關的QTLs,其中,qSV-1、qSV-5b、qSV-6a、qSV-6b和qSV-11影響幼苗建成,qSV-5a、qSV-5c和 qSV-8僅影響發芽；此外,qSV-1、qSV-5b、qSV-6a、qSV-6b 和 qSV-8 是低溫特異性QTLs。Abe等[20]利用來自粳稻Kakehashi和Dunghan Shali雜交的RILs,鑒定到4個與苗高相關的QTLs,其中,控制苗高的qPHS3-2定位于Chr3長臂末端,并在該位點預測到一個與赤霉素(gibberellin,GA)生物合成相關的候選基因——OsGA20ox1。Jin 等[21]以野生稻(Oryza longistaminata)與秈稻9311雜交后,再以9311作為輪回親本得到的BC2F20回交株系(backcross inbred lines,BILs)為材料,運用基因組重測序技術進行基因分型,檢測到與種子活力相關的36個QTLs；其中,老化過程中種子萌發能力相關的q9GR8.1與q9GP8.1擁有相同的定位,該位點包含8個候選基因(MH08g0-020600、MH08g0020700、MH08g0020800、MH08g-0020900、MH08g0021000、MH08g0021100、MH08-g0021200和MH08g0021-300)；老化處理種子萌發后的幼苗長度相關的q9SL1.1與q3SL1.1和q6SL1.1有相同定位,該位點鑒定到15個候選基因(MH01g0725700、MH01g0725800、MH01g0725-900、MH01g0726000、MH01g0726100、MH01g072-6200、MH01g0726300、MH01g0726400、MH01g07-26500、MH01g0726600、MH01g0726700、MH01g0-726800、MH01g0726900、MH01g0727000 和 MH-01g0727100)。Sasaki等[22]從來自 Milyang23/Akihikari的RILs,檢測到了4個與種子壽命相關的QTLs(RC7、RC9-1、RC9-2 和 RC9-3)。Jiang等[23]從來自Milyang23/Tong88-7和Dasanbyeo/TR22-183的兩組RILs,發現了8個與種子貯藏耐性相關的 QTLs(qMT-SGC1.1、qMT-SGC5.1、qMTSGC7.1、qMT-SGC7.2、qMT-SGC9.1、qDT-SGC2.1、qDT-SGC3.1 和 qDT-SGC9.1)。Li等[24]利用 Koshihikari/Kasalath的BILs種子,鑒定到位于Chr2、Chr3、Chr4、Chr6、Chr9 和 Chr11 上與種子貯藏耐性相關的 6 個 QTLs(qSS-2、qSS-3、qSS-4、qSS-6、qSS-9 和 qSS-11)。Miura 等[11]使用 Nip-ponbare/Kasalath的BILs,在Chr2、Chr4和Chr9上鑒定到3個與種子壽命相關的QTLs(qLG-2、qLG-4和qLG-9)。Zeng等[25]利用來自秈粳雜交ZYQ8/JX17的DH株系，檢測到分別位于 Chr9、Chr11和Chr12上的與種子貯藏耐性相關的3個QTLs(qLS-9、qLS-11和qLS-12)。Xue 等[26]使用來自秈粳雜交IR24/Aso-minori的RILs,獲得了分別位于Chr1、Chr3和Chr9上與種子貯藏耐性相關的3個QTLs(qRGR-1、qRGR-3 和 qRGR-9)。Lin 等[27]使用以N22作為共同親本的Nanjing35(ja-ponica)/N22//Nanjing35的BILs和USSR5(japoni-ca)/N22的 RILs,在Chr1、Chr2、Chr5、Chr6 和 Chr9 上鑒定到7個QTLs,包括兩個群體種子所共有的qSSn-9,只存在于 BILs的 qSSnj-2-1、qSSn-2-2、qSSn-5、qSSn-6和只存在于RILs的qSSn-1。Hang等[28]利用Sasanishiki(粳稻)/Habataki(秈稻,有強貯藏耐性)//Sasanishiki的 BILs,在 Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr5、Chr7、Chr11 和 Chr12上鑒定到與種子貯藏耐性相關的13個QTLs,其中兩個QTLs(qSSh-2-1和qSSh-2-2)與自然和人工老化均相關,4個 QTLs(qSSh-4、qSSs-5-1、qSSs-5-2和 qSSh-12)和 7 個 QTLs(qSSh-1、qSSh-3-1、qSSh-3-2、qSSh-3-3、qSSh-7-1、qSSh-7-2 和 qSSh-11)分別與自然和人工老化相關。Yuan等[29]利用粳稻Nipponbare和秈稻9311的雜交后代的BILs,鑒定到位于 Chr1、Chr2、Chr3、Chr8、Chr9 和 Chr11 上與種子貯藏耐性相關的7個QTLs(qSS1、qSS2、qSS3.1、qSS3.2、qG6S8、qG6S9 和 qG6S11),其中qSS1被證實與種子貯藏耐性的改良有關,qSS3.1為種子貯藏耐性和抗氧化脅迫能力所共有；并從qSS3.1中篩選到1個編碼脂肪酸羥化酶的候選基因OsFAH2,過表達OsFAH2能降低種子中脂質過氧化和提高種子貯藏耐性。

1.2 小麥、玉米和大豆等農作物種子活力或抗老化能力相關QTLs和候選基因鑒定

當前,小麥、玉米和大豆等農作物中與種子活力或抗老化能力相關的QTLs也有報道。Shi等[30]利用小麥Hanxuan 10×Lumai 14雜交后代的DH品系,挖掘出與種子活力相關的49個QTLs,分別定位 于1B、2D、3A、3B、3D、4A、4D、5A、5B、5D、6D和7A等12條染色體上,并從Chr5B上分布的13 個 QTLs(QGEe5B、QGIe5B、QSLc5B、QSLd5B、QSLf5B、QRLd5B、QRLe5B、QRLf5B、QVId5B、QVIe5B、QVIf5B、QSVId5B 和 QSVIe5B)鑒定到 7 個候選基因(gRAESCS5B01G564900、gRAESCS5B0-1G5642 00、gRAESCS5B01G562600、graesCS5B02-G562700、gRAESCS5B01G561300、gRAESCS5B01-G561400和gRAESCS5B01G562100),這些基因主要參與調節老化種子萌發期間的碳水化合物和脂質代謝,轉錄和細胞分裂等。Han等[31]基于兩個玉米雜交組合Yu82×Shen137和Yu537A×Shen137,通過單粒系選法獲得兩類F10RIL群體,鑒定到與種子活力相關的65個QTLs,其中61個QTLs被整合為18個meta-QTLs(mQTLs)(用Bio-Mercator 2.1對每條染色體上的QTLs進行整合分析,當整合得到的某個QTL簇是兩類RIL群體共有時稱為1個mQTL),并從13個mQTLs(mQTL1-1、mQTL1-2、mQTL3-1、mQTL3-2、mQTL3-3、mQTL3-4、mQTL4-2、mQTL4-3、mQTL5-2、mQTL6-1、mQTL6-2、mQTL7-1 和 mQTL7-2)中鑒定到與玉米種子活力相關的24個候選基因(226532762、224061823、242056533、195605946、162459222、327195227、302810918、At1g45050、224143836、162459414、At5g19550、AT5G51440、195658029、226508796、At3g04120、326509331、AT1G57720、At5g67360、45238345、At1g70730、AT1G09640、226247007、AT1-G56340 和 AT3G21720),它們主要參與糖酵解途徑和蛋白質代謝；且推測mQTL2、mQTL3-2、mQTL3-4和mQTL5-2的染色體區域可能是與種子活力相關的熱區(hot spots)。Zhang等[32]以大豆品種Zhengyanghuangdou×Meng 8206(ZM6)與 Linhefenqingdou × Meng 8206(LM6)雜交的兩個RILs為材料,共鑒定出11條染色體上與種子貯藏耐性相關的34個QTLs,其中21個QTLs分布在 4條染色體(Chr3、Chr5、Chr17和 Chr18)上5個QTL簇中,位于Chr17和Chr5的兩個簇上的QTLs的密度最高,各有7個QTLs(qrGR-17-1、qr-GR-17-2、qrFW-17-1、qrFW-17-2、qrGR-17-3、qrSL-17-1 和 qrFW-17-3)和 6 個QTLs(qGR-5-1、qGR-5-2、qFW-5-1、qGR-5-3、qFW-5-2 和qrSL-5-1),分別被定義為QTL hotspot A和QTL hotspot B。研究人員從這兩個熱點區域中已篩選到與種子發育、萌發和休眠,種皮形成,脂肪酸/脂質代謝過程和種子貯藏耐性等相關的19個候選基因(Glyma05g25030、Glyma05g25320、Glyma05g25460、Glyma05g25970、Glyma05g26150、Glyma05g26830、Glyma05g27190、Glyma05g27240、Glyma05g27250、Glyma05g28250、Glyma05g28950、Glyma05g29190、Glyma05g28030、Glyma05g28720、Glyma17g36080、Glyma17g36620、Glyma17g36730、Glyma17g37090和Glyma17g37110),但這些候選基因調控種子活力或抗老化能力的分子作用機制及哪個或哪些是關鍵基因或主效基因、彼此間是否存在相互作用等尚未見報道。

2 GWAS和多組學分析優化種子活力或抗老化能力相關QTLs和候選基因

2.1 GWAS用于鑒定種子活力或抗老化能力相關QTLs和候選基因

全基因組關聯分析(genome-wide association study,GWAS)是以研究對象的基因組中大量單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)為分子遺傳標記,通過將SNPs與某數量性狀進行連鎖作圖,來獲得該性狀的QTLs的分析方法。與QTL連鎖分析相比,GWAS通常使用大量不相關的多樣化種質為試驗材料,以增加等位基因和單倍型的多樣性,從而克服了QTL分析只能在特定F2代的雜交親本之間或RIL群體內進行等位基因多樣性分析,以及遺傳圖譜分辨率受到重組株系數量限制的缺點[33～34]。近年來,GWAS在種子抗老化能力的分子機制研究上已得到廣泛應用。

Renard等[35]對經自然老化和加速老化處理后的270個自然變異的擬南芥(Arabidopsis thaliana)種質的種子進行GWAS分析,確定了多個與種子壽命相關的基因區域,在Columbia生態型中鑒定到20個與種子活力相關的候選基因,其中7個(PSAD1、SSLEA、SSTPR、DHAR1、CYP86A8、MYB-47和SPCH)與種子壽命正相關,5個(RBOHD、RBOHE、RBOHF、KNAT7 和 SEP3)與種子壽命負相關；且證明氧化脅迫相關的RBOHs(NADPH氧化酶基因)、DHAR1(脫氫抗壞血酸還原酶基因)和PSAD1(光系統Ⅰ亞基基因)在種子老化過程中扮演主要角色,CYP86A8(細胞色素P-450羥化酶基因)和轉錄因子基因(MYB47、KNAT7 和 SEP3)在種子老化過程中對種皮有保護作用。

通過GWAS分析,熊豆[36]從271份水稻種質中共檢測到48個種子貯藏耐性相關SNPs,其中,3個SNPs與人工老化處理相關聯,45個SNPs與自然老化相關聯；同時,從其中兩個SNPs dd110-00467(Chr11_21953047)和id11008475(Chr11_22-000109)的上、下游各100 kb區域內鑒定到控制水稻種子貯藏耐性的兩個候選基因Os011g37640和Os011g37730,它們在發芽率高的材料中的相對表達水平顯著低于發芽率低的品種。Lee等[37]從299個秈稻種質中鑒定到與種子壽命相關的8個候選基因(Os03g51050、Os04g01160、Os04g01280、Os09g37250、Os11g01439、Os03g06890、Os03g069-00和Os03g03870),它們主要參與DNA修復、轉錄、糖代謝、活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除以及胚胎和根發育過程等。Wu等[38]從456個不同水稻種質中發現了9個新的QTLs(qSS1-1、qSS1-2、qSS2-1、qSS3-1、qSS5-1、qSS5-2、qSS7-1、qSS8-1和 qSS11-1),其中,qSS1-2和 qSS8-1分別與已報道的qSS1/OsGH3-2和OsPIMT1共定位；并發現這些QTLs可以很好地解釋為何水稻秈亞種的種子的貯藏耐性優于粳亞種的種子。最近,Yuan等[39]通過對不同水稻種質的種子進行GWAS分析發現,吲哚-3-乙酸(IAA)-酰胺合成酶基因(GRETCHEN HAGEN3-2,OsGH3-2)是一個種子貯藏耐性相關基因,OsGH3-2主要在發育的種子中表達并催化IAA與氨基酸結合,使其形成無活性的生長素；OsGH3-2的過表達顯著降低種子的貯藏耐性,而基因敲除或敲低增強種子的貯藏耐性；OsGH3-2可能通過調節脫落酸(abscisic acid,ABA)信號途徑作為種子貯藏耐性的負調節因子。Shi等[40]對478個不同水稻品種的種子在鹽脅迫條件下的萌發相關性狀進行GWAS分析,鑒定到11個與耐鹽性顯著相關的QTLs,其中位于Chr2的一個QTL包含兩個硝酸鹽轉運蛋白家族基因OsNRT2.1和OsNRT2.2,其表達受到鹽脅迫的影響。Magwaa等[41]對350個水稻indica、japonica和Aus亞型品種的種子休眠特性進行GWAS分析,鑒定到16個SNPs與新鮮收獲種子的萌發率相關聯,38個SNPs與后熟種子的萌發率相關聯(其中3個也是存在于新鮮收獲種子中的SNPs)；在新鮮收獲種子中,有3個關聯SNPs與GA/IAA鈍化基因GA2ox3、EUI1和GH3-2以及休眠基因Sdr4距離約100 kb；在后熟種子中,有1個關聯SNP毗鄰ABA信號轉導基因ABI5。

胚芽鞘長的小麥品種對于深播種植有積極意義。然而,對GA不敏感的矮化基因Rht-B1b和Rht-D1b的廣泛使用不利于培育具有胚芽鞘長的矮化小麥品種。Li等[42]對893個小麥品種進行GWAS分析,鑒定到8個胚芽鞘長度相關QTLs(QCL.stars-4DC1、QCL.stars-4BS1、QCL.stars-2DC1、QCL.stars-2DS1、QCL.stars-5BL1、QCL.stars-1BS1、QCL.stars-4BS2和QCL.stars-5B/5D),且證明Rht-B1b和Rht-D1b的表達顯著降低胚芽鞘長度。種子活力也影響幼苗的根系統建成(root system archi-tecture,RSA),該性狀對于農作物在脅迫條件下的水分和養分利用十分重要。Alemu等[43]對192個小麥品種進行GWAS分析,鑒定到38個RSA相關QTLs,其中 4個QTLs(EPdwRGA-6A、EPdwRDW-4A、EPdwiTGW-3B.1和 EPdwIRW-5A)特別是 EP-dwRGA-6A可能對RSA起關鍵作用。

Nagel等[44]通過對175個大麥(Hordeum vulgare)品種的種子進行GWAS分析,發現了基因型、非生物和生物脅迫影響種子老化和壽命的107個標記性狀關聯(marker trait associations,MTAs)；未發現種子老化與脂溶性生育酚、油、淀粉和蛋白質含量之間存在相關性；而長期干燥貯藏或人工老化處理的種子中,水溶性谷胱甘肽和相關硫醇轉化為二硫化物,表明其細胞內變得更具氧化性；不同貯藏和老化方式影響細胞內pH和生化過程進而導致種子老化；此外,種子響應老化處理或貯藏耐性似乎受到母本環境(maternal environment)和遺傳背景的顯著影響。

Huang等[45]對 650個燕麥(Avena sativa)株系種子活力相關性狀進行GWAS分析,獲得根、芽性狀相關QTLs分別為34個和16個,各對應于41個和16個SNPs；其中5個性狀關聯位點的序列與水稻、短柄草和玉米的同源序列匹配,且3個性狀關聯位點的序列與種子活力相關的基因匹配,分別是葡糖醛酸基轉移酶基因(Os01g067550-0、Bradi2g46410 和 Zm00001d043879)、包含線粒體載體蛋白結構域的蛋白編碼基因(Os03g0191100、Bradi1g71800、Zm00001d048218 和 Zm00001d02-8008)和鐵硫簇蛋白基因(Os06g0146400d、Bradi-1g51010.1d 和 Zm00001d036145)。

Upadhyaya等[46]對242份高粱(Sorghum bicolor)種質進行GWAS分析,發現1個SNP關聯位點(Locus 7-2)與種子的低溫發芽顯著相關,該位點與高粱耐寒性相關的QTL qSbCT07.10共定位[47],并鑒定到1個編碼CBL(calcineurin B-like protein)-互作蛋白激酶的候選基因(007G140900),該基因與水稻Chr8上的耐冷性基因LOC_Os08g34240高度同源[48～49],其小麥同源基因(TaCIPK14)在煙草中過表達時,能提高煙草種子的耐寒性和發芽率[50]。

通過GWAS分析,Tan等[51]從520個油菜(Brassica napus)品種中鑒定到干旱和鹽脅迫條件下23個SNPs關聯位點與種子萌發率相關,20個SNPs關聯位點與種子萌發指數相關,其中,位于Chr_C08的SNP關聯位點與鹽和干旱響應基因BnaC08g41070距離3.32 kb,位于Chr_A4的SNP關聯位點與干旱響應基因BnaA04g02620D距離2.20 kb,位于Chr_C06的SNP關聯位點與干旱響應基因BnaC06g01910D重疊；此外,還鑒定到37個與干旱和鹽脅迫下種子萌發率或萌發指數相關的候選基因,且這些候選基因大多數調節信號轉導和脯氨酸生物合成,或編碼泛素連接酶(ubiquitin ligase)E3。Hatzig等[52]從248個油菜品種中鑒定到幾個候選基因所在的基因組區間與種子萌發率、萌發速率、幼苗生長和千粒重等性狀相關聯,且其中有些是擬南芥基因SCO1(SNOWY COTYLEDON 1)、ARR4(ARABIDOPSIS TWO-COMONENT RES-PONSE REGULATOR 4)和ATE1(ARGINYL-t-RNA PROTEIN TRANSFERASE 1)的同源基因。Luo等[53]基于442個油菜品種在低溫和正常溫度條件下的種子萌發和幼苗生長特性差異,鑒定到22個與種子活力的低溫脅迫耐性顯著關聯的QTLs,并從中篩選到62個候選基因,這些基因的功能涉及DNA修復、RNA翻譯、線粒體激活和能量產生、蛋白質的泛素化和降解、抗氧化系統以及植物激素和信號轉導等,其中最值得關注的有BnaA03g40290D、BnaA06g07530D、BnaA0-9g06240D、BnaA09g06250D和BnaC02g10720D等。

2.2 多組學分析鑒定種子活力或抗老化能力相關基因及其代謝途徑

種子活力或抗老化能力的多組學(multi-omics)分析包括全基因組水平上的轉錄組學、蛋白質組學、降解組學和代謝組學分析等,可全面鑒定相關基因及其代謝途徑[54]。

2.2.1 基因組學和蛋白質組學分析鑒定種子活力或抗老化能力相關基因及其代謝途徑

迄今為止,已有大量與種子活力相關的轉錄組學和蛋白質組學的研究報道。

Li等[55]通過對壽命長短不一的兩個玉米株系的種子進行人工老化處理前后的轉錄組比較分析,從差異表達基因中挖掘出13個可能與種子壽命相關的基因(GRMZM2G058970、GRMZM2G3-02913、GRMZM2G358618、GRMZM2G375807、GRMZM2G379913、GRMZM2G379929、GRMZM2G43-8938、GRMZM5G867767、GRMZM2G181135、GRMZM5G800586、GRMZM5G877838、GRMZM2G07-4604和GRMZM5G824439),其中11個基因在Chr3上,2個基因在Chr5上,10個基因有注釋信息。Gu等[56]對20個含油量不同的油菜品種種子進行蛋白質組學和基因組學整合分析,鑒定到165個差異蛋白質；含油量高的種子具有較高的代謝活性,尤其是含硫氨基酸代謝；31個特有基因在高含油量和低含油量種子的萌發過程中表現出顯著差異,其中13個基因(BnaC-01g43710D、BnaC-06g19960D、BnaC06g20420D、BnaA07g20290D、B-naA07g20210D、BnaA06g16950D、BnaC04g42010-D、BnaC06g09330D、BnaC03g70070D、BnaA07g33-310D、BnaC06g38200D、BnaC06g14990D 和 BnaC-06g14670D)可能與種子萌發活力相關。

針對具有不同活力水平的擬南芥種子的比較蛋白質組學結果表明,蛋白質合成能力、貯藏物質動員和細胞解毒作用相關蛋白質與種子活力密切相關[57]。Catusse等[58]分別對吸水促萌和人工老化處理獲得的不同活力的甜菜種子進行比較蛋白質組學分析,發現有18個蛋白質在吸水促萌處理時上調,老化處理時下調,且老化處理后再經吸水促萌處理時又上調；另有11個蛋白質則表現出相反的豐度變化。這些蛋白質涉及脂類和淀粉的動員、蛋白質合成或甲基循環等代謝途徑,乙醛酸酶、異檸檬酸裂解酶、蛋白質合成能力以及ABA信號途徑等相關的蛋白質被認為可能是種子活力的主要參與者。雜交水稻和白楊種子的蛋白組學研究也發現,能量代謝、細胞防御和修復相關蛋白質、貯藏蛋白、胚乳中與貯藏物代謝分解相關的酶、蛋白質合成與轉運相關蛋白質等在種子人工老化后變化很明顯,特別是胚中的糖酵解相關酶類以及丙酮酸脫氫酶和乙醇脫氫酶在種子老化期間豐度顯著增加,暗示它們與種子活力變化有關[59～60]。大豆種子的發育通常對高溫和高濕敏感,Wei等[61]研究發現,種子發育階段對高溫高濕耐性不同的兩個品種在子葉、胚和葉中分別有120、144和438個豐度差異蛋白質,這些蛋白質功能主要涉及信號轉導、三羧酸循環、脂肪酸代謝、光合作用、蛋白質加工、折疊和組裝、蛋白質生物合成或降解、植物-病原體相互作用、淀粉和蔗糖代謝以及氧化應激反應等代謝途徑和細胞過程,且高耐品種的細胞超微結構、上述代謝途徑和生理生化變化較小。Chen等[62]對不同含水量的燕麥種子在不同溫度條件下處理一定時間的蛋白質組和生理生化變化進行比較和關聯分析,獲得21個豐度有顯著差異的蛋白質,其中包括隨種子老化而下調的19個蛋白質和上調的2個蛋白質；下調蛋白質中有6個熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和2個ATP合酶,參與碳水化合物和能量代謝、平衡其他蛋白質的合成與降解等；上調蛋白質中有1個是精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthase),參與脯氨酸合成,可維持細胞中ROS穩態,對于種子的熱脅迫抗性十分重要。另有研究表明,OsHSP18.2(Ⅱ類胞質HSP)是一個老化反應蛋白質,在人工老化處理的水稻種子中豐度顯著上調；OsHSP18.2的轉錄產物在種子成熟后期顯著增加,在干種子中含量很高,而在種子發芽后急劇減少。生化分析表明,OsHSP18.2通過形成同源十二聚體,作為分子伴侶發揮作用,可防止檸檬酸合酶的熱失活,因此研究者認為OsHSP18.2可能通過限制ROS積累來保護和穩定細胞中酶的結構和功能,使其免受不可逆損傷,在種子成熟干燥、老化和萌發過程中,提高種子活力、壽命和有利于幼苗建成[63]。Wang等[64]研究了花生萌發種子胚軸不同部位脫水耐性及其蛋白質組學差異,發現一些特殊的LEA(late embryogenesis abundant)蛋白、脫水素(dehydrin)、鈣調蛋白(calmodulin)、脂氧合酶 3(LOX3)、ABA 響應蛋白以及脫毒反應相關蛋白質等的豐度與胚軸不同部位的脫水耐性高度相關。

miRNAs也參與種子活力或抗老化能力的調控,其中miR164c的表達與種子活力負相關,而miR168a的表達與種子活力正相關[65]。通過轉錄組學以及蛋白質組學差異分析和基因-蛋白質互作分析,研究人員發現miR164c通過其靶基因PSK5和TIL1調控核心基因RPS27AA,后者通過其下游的六大類功能蛋白質,包括脅迫響應、內質網蛋白加工、胚發育、絲氨酸內肽酶抑制劑、能量代謝和“其他”關聯蛋白質,共同調控水稻種子活力或抗老化能力[66]。

2.2.2 代謝組學分析鑒定種子活力或抗老化能力相關的代謝標志物

代謝組學(metabonomics/metabolomics)分析指對生物體內所有代謝物進行定量分析,以探討代謝物與生物體生理病理變化的關系。近期,該技術已被用于鑒定種子老化程度或種子壽命的代謝標志物(metabolic markers)。

種子引發(seed priming)是改善種子活力的重要措施。最近,基于納米材料的小尺寸和獨特的物理化學特性,納米引發物開始應用于種子萌發特性的改良。比如,使用洋蔥(Allium cepa)提取物作為還原劑合成銀、金納米顆粒,以及使用食品工業副產品柑橘籽油和去除姜黃素后的姜黃油樹脂制備納米乳液,用于引發洋蔥種子,可增加種子發芽率和出苗率；代謝組學研究表明,納米材料引發處理后洋蔥種子和幼苗中的ABA和順式-(+)-12-氧代植物二烯酸(cis-(+)-12-oxo-phytodienoic acid)的產生受到顯著抑制,萌發促進物如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)和玉米素(zeatin)的含量則增加[67]。適當濃度的激動素處理苜蓿(Medicago truncatula)種子可加速其萌發,但會傷害幼苗生長。采用非靶向代謝組學(non-targeted metabolomics)分析經水和0.5 mmol/L激動素分別浸泡2 h和8 h的苜蓿種子以及胚根伸出階段種子中的代謝物組成,結果表明,無論是水或激動素浸泡處理,五磷酸肌醇、胍丁胺、二半乳糖基甘油、六磷酸肌醇和油酰膽堿等是3個不同處理的種子中主要的差異代謝物；27種代謝物的平均相對含量在激動素與水處理之間形成顯著差異,但僅發生在胚根伸出階段；這些代謝物消耗可能與種子更快的發芽有關；較長時間暴露于激動素引起的DNA損傷或基因毒性損傷(genotoxic injury)可能是激動素傷害幼苗生長的原因[68]。

Chen等[69]對來自4個不育系和4個恢復系的16個雜交水稻組合的種子進行人工老化和自然老化處理后的代謝組學分析,共鑒定出56個代謝物,其中大多數與初級代謝有關；在種子老化過程中,半乳糖、葡萄糖酸、果糖和甘油的含量顯著增加；絕對定量結果表明,在不同老化處理下,半乳糖和葡萄糖酸與種子的發芽率極顯著負相關；棉子糖的相對含量在種子貯藏過程中變化不大,但與人工老化種子的發芽率顯著正相關。Min等[70]將正常組和人工老化組人參種子均用赤霉素處理后,使用氣相色譜-質譜(GC-MS)分析比較兩組樣品之間的代謝物變化,確定了44種內源性代謝物,其中9種含量呈顯著差異的代謝物可作為預測人參種子壽命的潛在標志物。

2.2.3 降解組學分析鑒定種子活力或抗老化能力相關的miRNAs及其靶基因

降解組測序(degradome sequencing)主要針對miRNA介導的mRNA剪切片段進行測序,從而篩選miRNA作用的靶基因。降解組學分析已用于鑒定與種子活力或抗老化相關miRNAs及其靶基因。Gong等[71]分別對正常的和人工老化處理2 d的玉米種子進行miRNA測序,共發現27個差異表達的miRNAs,其中10個被RT-qPCR證實；降解組測序共鑒定到1 142個可能被131個miRNAs切割的靶轉錄本,其中9個差異表達的miRNAs的26個靶基因可能在種子活力調控中發揮作用。Huang等[72]分別對二倍體水稻和四倍體水稻的種子進行老化處理,結果表明,四倍體水稻種子的抗老化能力強于二倍體水稻種子。降解組測序發現,Osa-miR164d的靶基因轉錄本的降解片段只在四倍體水稻種子中檢測到,推測OsamiR164d可能通過調控靶基因的差異表達參與調控水稻種子抗老化能力,該結果與本研究室關于miR164c調控水稻種子活力的作用機制[65～66]一致。

3 種子活力或抗老化相關基因的功能及其分子作用機制研究

基因編輯技術是研究基因生物學功能的主要手段,包括過表達(overexpression)轉基因技術、基因敲除或敲減技術(knockout/knockdown)、基因沉默(RNAi)技術等[73～75]。這些技術在種子活力或抗老化能力相關基因的功能及其分子作用機制研究中發揮了重要作用。

3.1 活性氧毒性清除相關基因的功能及其分子作用機制

種子在脫水、貯藏和萌發過程中,不斷地產生有毒副產品ROS,導致種子劣變以致壽命下降。ROS的毒性源于其不加區別地與細胞中幾乎所有組分如脂質、蛋白質和DNA等發生反應。由ROS引起的基因組傷害被認為是種子老化的重要原因之一,如引起DNA中形成7,8-二氫-8-氧鳥嘌呤(7,8-dihydro-8-oxoguanine,8-oxo-G),該產物在DNA復制過程中與腺嘌呤而不是胞嘧啶形成堿基對,從而導致GC→TA顛換。有研究表明,擬南芥中的AtOGG1參與堿基切除修復,清除DNA中的8-oxo-G。AtOGG1的轉錄本在種子干燥和萌發吸水過程中顯著上調,同時在轉基因種子中8-oxo-G含量下降,提示過表達該基因增強了種子的非生物脅迫耐性,延緩老化,進而延長種子壽命[76]。另外,在許多植物中,1-Cys過氧化物酶(1-cys peroxiredoxin,1-Cys Prx,也稱為PER1)是一類種子專一性抗氧化劑,可保護半胱氨酸殘基免受ROS的傷害。Chen等[77]從荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)種子中鑒定和表征了NnPER1蛋白,NnPER1能夠保護DNA免受ROS的切割,NnPER1的轉錄和蛋白質積累在種子干燥、吸漲以及非生物脅迫處理期間增加；NnPER1在擬南芥中的異位表達可提高擬南芥種子的壽命和抗老化能力,且轉基因種子中ROS和脂質過氧化水平顯著低于野生型種子。

3.2 脂氧合酶基因的功能及其分子作用機制

膜脂的過氧化和自由基的增殖是種子活力下降的兩個重要原因[10]。脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是催化不飽和脂肪酸代謝的關鍵酶之一,隨著LOX活性的增加,不飽和脂肪酸的水平降低,脂肪酸被氧化,形成自由基,然后種子迅速變質[14]。LOX家族的一些成員在種子萌發過程中起到降解脂質的作用。在種子貯藏過程中,由于LOX活性增強,不飽和脂肪酸發生過氧化反應,會直接導致種子活力降低和谷物營養品質變差,因此LOX與種子壽命和抗老化能力關系密切,通過RNAi技術降低種子中LOX活性可以提高種子的抗老化能力[78]。比如,與野生型相比,過表達OsLOX2水稻株系的種子在正常條件下萌發加速,貯藏過程中種子加速老化,活力加速降低；而OsLOX2的RNAi導致種子發芽延遲和壽命延長,但Os-LOX2活性受到強烈抑制的RNAi株系的種子在加速老化后完全失去發芽能力,因此若既要不影響正常條件下種子發芽,又能延緩貯藏中種子的老化進程,適當抑制OsLOX2的表達可能是必要的[79]。另有研究報道,缺失脂氧合酶LOX3的水稻種子在貯藏過程中的抗老化能力比LOX3正常的水稻種子強；OsLOX3反義構建體的轉基因水稻種子的胚乳中OsLOX3表達下調、OsLOX mRNA水平顯著降低,LOX3的活性即將亞油酸轉化為9-氫過氧十八碳二烯酸(9-hydroperoxyoctadecadienoic acid,9-HPOD)的能力顯著低于野生型種子,該轉基因植株表型和生命周期正常,但種子的貯藏耐性得到改善[80]。

3.3 乙醛脫氫酶基因和醛-酮還原酶基因的功能及其分子作用機制

水稻的乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase 7,OsALDH7)可能通過解毒脂質過氧化產生的醛,從而維持種子活力。OsALDH7的T-DNA插入突變體受非生物脅迫顯著影響,突變體種子在干燥和貯藏過程中,胚乳有類黑素(melanoidin)積累；與野生型相比,突變體種子對人工老化處理更敏感,并且積累更多的丙二醛[81]。在種子貯藏過程中脂質過氧化介導產生的還原性羰基化合物(reactive carbonyl compounds,RCC)也是細胞毒性物質之一,其積累會降低種子活力。醛酮還原酶(aldo-ketoreductase,AKR1)對RCC的解毒作用能夠延長種子壽命,AKR1過表達的水稻和煙草種子的抗老化能力明顯高于野生型[82]。

3.4 L-異戊烯基甲基轉移酶基因的功能及其分子作用機制

非生物脅迫會加速細胞內蛋白質中異天冬氨酰(isoAsp)殘基的形成,從而影響蛋白質結構和功能。L-異戊烯基甲基轉移酶(protein L-isoaspartyl methyltransferase,PIMT)通過將有害的isoAsp殘基恢復為功能性天冬氨酰殘基來修復其他蛋白質[83]。該酶在植物中有兩個不同的編碼基因—PIMT1和PIMT2。早在1993年,即有報道PIMT可能與小麥種子的生活力有關[84]。擬南芥種子中PIMT1含量增加可降低蛋白質中isoAsp殘基的積累,使種子壽命延長和活力提高；相反,PIMT1含量減少時,新鮮的干燥成熟種子的蛋白質中isoAsp殘基的積累量增加,導致種子對老化處理的敏感性提高和在脅迫發芽條件下種子活力喪失[85]。不同PIMT亞型的生化活性有差異,在發育、成熟以及暫時靜止狀態的正常水稻種子中高活性PIMT是必需的[86]。Wei等[87]從水稻中克隆到兩個PIMT基因——OsPIMT1和OsPIMT2,翻譯產物OsPIMT2主要存在于綠色組織的葉綠體和細胞核中,而OsPIMT1在種子胚中大量積累；OsPIMT1突變株系的種子對人工老化高度敏感,而過表達株系的種子中減少了isoAsp殘基的積累,種子活力增強,人工老化21 d的過表達株系種子的發芽率與野生型相比提高9%～15%；來自OsPIMT1 RNAi株系的種子在胚中過度積累isoAsp殘基,種子發芽能力快速喪失。同樣,人工老化處理后的鷹嘴豆(Cicer arietinum)種子發芽率顯著降低,種子中CaPIMT活性也降低；進一步研究表明,CaPIMT2可使核蛋白中的異常isoAsp殘基得到修復,而CaPIMT1主要在細胞質部分修復此類異常蛋白質,從而增強種子活力和壽命[88]。

3.5 生育酚(維生素E)基因的功能及其分子作用機制

生育酚(tocopherols或vitamin E,維生素E)是植物合成的一類親脂性抗氧化劑,在種子中含量特別高。Simontacch等[89]發現大豆胚軸中α-tocopherol含量隨種子所處的外界氧化脅迫條件而發生變化,高活力或抗氧化能力強的種子中α-tocopherol含量也高。Sattler等[90]在擬南芥中分離并表征了兩個維生素E基因(VTE1和VTE2),這兩個基因的突變都會導致組織中生育酚缺乏；但兩者作用機制有區別,vte1破壞生育酚環化酶活性并積累氧化還原生物合成中間產物,而vte2破壞尿黑酸植基轉移酶(homogentisate phytyltransferase)的活性,不積累中間產物；與野生型相比,這兩個基因中任何一個突變均會導致種子壽命大大降低。

3.6 金屬硫蛋白基因和熱激蛋白基因的功能及其分子作用機制

金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一類能夠結合金屬離子的低相對分子質量、富含半胱氨酸的蛋白質,主要參與生物體內重金屬離子的穩態維持和活性氧的清除反應。在植物中,HSPs極其豐富和多樣,并且與多種非生物脅迫逆境有關。周玉亮[91]研究蓮MTs和HSPs的生物學功能時發現,過表達 NnMT2a、NnMT3或 NnHSP17.5的擬南芥種子與野生型種子相比表現出更強的抵抗人工老化的能力。Yuan等[92]研究發現,在水稻中,Os-MT2b(MET-ALLOTHIONEIN2b)優先在水稻未成熟穗、萌發胚的盾片和側根原基中表達,且細胞分裂素下調其表達；在OsM-T2b過表達和RNAi轉基因植株中,內源細胞分裂素——異戊烯基腺苷(isopentenyladenosine)的含量差異表明,OsMT2b可能通過反饋調節內源細胞分裂素水平而參與水稻根發育和種子胚萌發的調控。

4 展望

在貯藏過程中,種子老化或活力下降是不可避免的,每年農作物種子因老化而給農業生產造成巨大損失[93]。近十多年來,分子生物學技術應用于種子活力或抗老化能力領域的研究,取得了顯著進展,越來越多的種子抗老化相關基因得到發掘和克隆。對這些基因的生物學功能、基因之間的相互作用及其分子調控機制的研究,將有助于闡明種子活力或抗老化能力的分子調控機制；在分子設計育種中,通過基因編輯技術對獲得的優良基因進行整合和開發利用,可望培育出種子抗老化的農作物新品種,從而確保種質資源的長期保存,以及滿足農業生產對高質量種子的需求。