仿生型復合補片在大鼠腹壁缺損中的應用研究*

王憲朋，鄭曉霞，孫淑萌，英永，李文明，王勤，劉陽，尹弢

(山東省藥學科學院 山東省醫用高分子材料重點實驗室，濟南 250101)

1 引 言

腹部外傷、腫瘤切除、組織感染等均會造成腹壁缺損[1-2]，進而導致腹壁疝的發生。自Lichtenstein提出“無張力疝修補術”概念后[3]，補片材料迎來飛速發展[4-5]。然而，補片置入腹腔后，有與腔內臟器發生粘連的可能，甚至會引發較嚴重的并發癥[6-7]。人工合成補片因價格低廉、來源廣泛[8-10]，在臨床使用中具有顯著優勢，但上市產品均存在過量瘢痕增生、粘連和術后慢性疼痛等缺陷[11-12]。為降低補片植入導致的粘連程度，本研究以一種仿生型復合補片為試驗組與對照組聚丙烯網補片的動物試驗結果進行了對比，評價臟器與腹壁修復區域的粘連優良率及新生血管生長、腹膜修復等情況。

2 材料和方法

2.1 試驗動物、試劑與儀器

健康SD大鼠，SPF級，10只，訂購體重160～180 g，試驗時體重200 g左右，動物合格證號為37009200020173，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，飼養于萬級屏障環境中。

聚丙烯網補片，日照天一生物醫療科技有限公司；仿生型復合補片，自制；SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫組化試劑盒，上海瑞齊生物科技有限公司；Rabbit Anti-CD31單抗、DAB染色試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司；戊巴比妥鈉，25 g/瓶，德國默克公司；注射用青霉素鈉，山東魯抗醫藥股份有限公司；生理鹽水若干。

熒光顯微鏡，Ni-U，日本尼康公司；石蠟切片機，RM2245，德國徠卡公司。

2.2 建立大鼠腹壁缺損模型

大鼠禁食12 h后，用1%戊巴比妥鈉溶液行腹腔注射麻醉，腹部脫毛，常規消毒鋪巾，取腹部正中位置切開皮膚及皮下組織，將皮下組織及深層筋膜鈍性分離，肌層顯露后切除掉兩側的腹壁肌肉及腹膜，在腹壁上形成1個約1 cm×1 cm的方形缺損，腹壁缺損模型建立完成。使用生理鹽水對腹腔進行沖洗，將殘余液體吸凈后放置補片。對照組使用傳統聚丙烯網補片，試驗組使用仿生型復合補片，使用5-0絲線將補片固定于腹壁缺損肌肉邊緣，然后用4-0絲線將皮下組織及皮膚間斷縫合，無菌紗布對切口覆蓋。尾部標記后單籠飼養。術后青霉素抗炎3 d，觀察一般情況。

術后4周處死動物，開腹觀察試驗動物創面粘連情況并評分，觀察創面愈合情況。同時取缺損部位2 cm進行組織學觀察。

2.3 評價方法

2.3.1大體觀察 術后每天肉眼觀察試驗大鼠的狀態，包括缺損部位是否出現局部炎癥、傷口裂開、感染等情況。

2.3.2粘連情況 參照國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心發布的《腹腔內置疝修補補片動物實驗技術審查指導原則》[13]，選用粘連強度、粘連面積為量化指標，評價補片植入4周后與腹腔內組織器官的粘連情況，進而對兩個指標的量化得分進行綜合評價。

以試驗動物的粘連綜合情況為標準，評價補片與臟器之間的粘連情況，粘連情況綜合評價優或良即為臨床可接受的粘連情況。以粘連情況評分為優或良的例數在總例數中的百分比為粘連情況優良率，見式(1)。

粘連情況優良率=

(1)

2.3.3病理檢查 取修補區域腹膜組織，用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，厚度5 μm。分別進行HE染色和Masson染色，于光鏡下觀察修復組織成纖維細胞的增殖效果，觀察缺損部位膠原的形成。

CD31免疫組化染色：4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，抗原修復，3%去離子水孵育15～20 min。加入試劑A室溫避光孵育20 min后，添加PBS適當比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次3 min；添加試劑B室溫避光孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；添加試劑C室溫避光孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；顯色劑顯色；蘇木素復染3 min，分化后自來水沖洗。脫水后，將切片由二甲苯中取出晾干，中性樹膠封片后，顯微鏡鏡檢，收集圖像。以CD31免疫組化染色結果評價新生毛細血管長入情況。

3 結果與討論

3.1 大體觀察

術后縫合部位出現紅腫，3 d后紅腫現象逐漸消失，試驗組和對照組動物縫合區域均未出現局部炎癥、明顯隆起、傷口裂開、感染等情況。

3.2 粘連情況

選用粘連強度和粘連面積兩個指標評價補片與腹腔內臟器的粘連程度，評分標準見表1。以粘連強度評分和粘連面積評分為依據，將粘連情況綜合評價分為優、良、中、差四個等級，評分標準見表2。試驗組4只動物僅有1處輕微粘連，一拉即開，粘連強度評分為1分，粘連面積占補片與組織接觸總面積25%以下，粘連面積評分為1分。由表2可知，試驗組4只動物的粘連情況綜合評價為優；試驗組1只動物無粘連發生，粘連情況綜合評價為優。試驗組粘連情況優良率為100%。對照組3只動物有多處粘連，尚能分離，粘連強度評分為2分，粘連面積占補片與組織接觸總面積30%左右，粘連面積評分為2分。由表2可知，對照組3只動物的粘連情況綜合評價為良；對照組2只動物有多處粘連，較難分離，粘連強度評分為3分，粘連面積占補片與組織接觸總面積40%左右，粘連面積評分為2分，粘連情況綜合評價為中。試驗組粘連情況優良率為60%。

表1 粘連情況評分標準

表2 粘連情況綜合評價表

補片植入4周后，試驗組和對照組的粘連程度差異較明顯，試驗組和對照組腹腔內粘連情況觀察結果見圖1。由圖1可知，試驗組補片與腹腔內臟器幾乎無粘連發生，而對照組動物腹腔內臟器與補片之間的粘連情況較明顯。由此可見，仿生型復合補片較傳統聚丙烯網補片具有優異的防粘連效果。這可能是因為，仿生型復合補片是由靜電紡絲層、親水層及支撐層構成，靜電紡絲層起物理屏障作用的同時，親水層中的親水性材料為組織修復細胞提供更有利的生長和遷移環境[14]，促進成纖維細胞的適度增殖，加速腹膜化，從而有效抑制損傷部位和相鄰臟器之間粘連的發生。

圖1 試驗動物腹腔內粘連情況

3.3 病理檢查

對腹壁缺損部位的組織切片進行HE染色，并在光鏡下觀察其病理情況，結果見圖2。圖2中，試驗組和對照組在低倍鏡下(HE×20)均可觀察到腹膜及腹膜下組織內已有肉芽組織形成，腹膜下組織內含多灶性大小不等的樣品，未降解樣品周圍被纖維組織包裹。高倍鏡下(HE×100)可見腹膜下組織內肉芽組織形成，組織內含多灶性大小不等的樣品，樣品未完全降解，周圍被纖維結締組織包裹，并有多核巨細胞形成。HE染色結果表明，試驗組和對照組的成纖維細胞均生長良好，缺損部位肉芽組織均已形成。

圖2 試驗動物腹壁缺損部位HE染色結果

采用MASSON染色方法對腹壁缺損部位的膠原纖維進行表征，試驗組和對照組的MASSON染色結果見圖3。由圖3可知，試驗組腹膜下組織內含多灶性大小不等的樣品，樣品未完全降解，周圍被纖維結締組織包裹，組織內膠原纖維藍染。對照組腹膜下組織內含未完全降解的樣品，樣品周圍被纖維結締組織包裹，組織內膠原纖維藍染。MASSON染色結果表明，試驗組和對照組缺損腹膜部位已有大量膠原生成，形成較為致密的纖維結締組織。

圖3 試驗動物腹壁缺損部位MASSON染色結果(HE×100)

免疫組化法檢測缺損部位組織CD31蛋白的表達，反映新生血管生成情況，試驗組和對照組的CD31免疫組化染色結果見圖4。由圖4可知，試驗組的腹膜下組織內有肉芽組織形成，組織內含未完全降解的樣品，樣品周圍肉芽組織內含多量棕染的新生血管。而對照組中，肉芽組織內含少量棕染的新生血管。由此可見，試驗組的新生血管情況優于對照組。

圖4 試驗動物腹壁缺損部位CD31免疫組化染色結果(HE×100)

缺損部位的膠原和新生血管生成情況可反映新生腹膜情況。相較于對照組，試驗組能夠更好地促進缺損部位的修復，加速新生腹膜的形成。這可能是因為仿生型復合補片具有優異的防粘連效果，抑制了成纖維細胞的過度增殖，從而為缺損部位間皮細胞、血管等的生長提供優良的修復環境。

4 結論

本研究考察了仿生型復合補片及聚丙烯網補片植入4周后臟器與腹壁缺損區域的粘連情況及腹壁缺損部位的修復情況。結果表明，試驗組的粘連情況優良率顯著優于對照組。病理檢查結果顯示，試驗組和對照組的成纖維細胞均生長良好，缺損部位肉芽組織形成，兩組均有新生膠原纖維和血管，但試驗組的新生血管多于對照組，表明試驗組缺損部位腹膜重新生長情況優于對照組。說明仿生型復合補片在修復缺損腹壁的同時，還具有較好的防粘連效果。