三江源區典型高寒草地叢枝菌根真菌多樣性及構建機制

李聰聰，周亞星，谷強，楊明新，朱傳魯，彭子原，薛凱，趙新全，王艷芬，紀寶明，張靜*

（1.北京林業大學草業與草原學院，北京100083；2.中國地質調查局西寧自然資源綜合調查中心（原武警黃金第六支隊），青海 西寧810021；3.中國科學院大學生命科學學院，北京100049；4.中國科學院大學資源與環境學院，北京100049；5.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧810008）

揭示驅動群落構建的生態過程一直是生態學研究的核心問題之一［1］。生態位理論強調確定性過程的重要性，包括環境過濾和生物過濾，而中性理論則認為群落的構建主要是由隨機過程或擴散限制決定的［2?3］。盡管這兩種理論存在明顯不同，但已被廣泛用于解釋生物群落多樣性及其維持機制［4］。近年來，有關驅動微生物群落構建生態過程的研究備受關注，許多研究注重于解析不同生態過程對微生物群落空間格局的重要性，有的研究認為環境因素對微生物群落分布的影響大于隨機過程［5?6］，也有研究認為擴散作用等隨機過程對微生物群落構建起決定性作用［7］，越來越多的生態學家則認為自然條件下的微生物群落組成是擴散限制、環境過濾和物種相互作用的結果［4，8?9］，即由確定性過程和隨機過程共同決定。目前有關生物群落構建機制缺乏一致性結論［10］，這將影響人們對生態系統穩定性與動態變化的認知。

土壤生物類群復雜多樣，包括細菌、真菌、古菌及線蟲等，它們作為生態系統的重要組分，在生物地球化學循環中發揮著非常重要的作用［11］。在所有的微生物中，叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是一類重要的內生菌根類真菌，能與大約80%以上的陸生維管植物形成共生關系，是自然界中分布最廣、功能最重要的一類菌根真菌［12?14］。AM 真菌是植物專性營養共生菌，宿主植物為其提供生存所需的碳水化合物，作為回報，它們則幫助宿主從土壤中獲取N、P 等礦物質營養和水分，提高植物抗逆性［15?16］。此外，AM 真菌還能調節植物種內之間的競爭關系［17］、促進生態系統演替［18］、穩定土壤結構［19］、提高植物生產力以及增加土壤碳固持［20］等。因此，AM 真菌物種多樣性及功能多樣性已成為衡量生態系統可持續性的一項重要指標［16，21?22］，成為當今菌根學研究關注的一個重點。AM 真菌的生態功能很大程度上依賴于其物種組成，因此，理解AM 真菌群落的構建機制對于預測AM真菌在自然界中的生態功能十分重要。已有研究表明，確定性因素在AM 真菌群落構建中起關鍵作用，如土壤養分可利用性［23］、光照強度［24］、降水［25］、pH［26］以及宿主植物［27］。然而，也有研究表明隨機過程，如擴散限制［26，28］對AM 真菌群落組成具有重要的影響。但是以上這些研究忽略了物種間親緣關系對AM 真菌群落構建的影響。廣泛應用于植物群落研究的譜系分析技術，不僅為研究AM 真菌群落構建提供了新思路，也強調了親緣關系在群落構建中的重要性，為推斷不同生態過程在驅動AM 真菌群落構建中的重要性提供了新方法。

青藏高原是我國重要的生態安全屏障和重要的草地畜牧業生產基地，其主要的高寒草地生態系統約占整個青藏高原總面積的66%［29?31］，主要包括高寒草甸、草原、荒漠和濕地。該地區最典型的生境特征為高海拔、日照多、氣溫低、日較差大、強輻射、生長季節短等，是陸地生態系統中典型的極端脅迫生境之一［32?36］。雖然生境條件惡劣，但是該地區生物資源豐富，這些生物的生存策略和維持機制已經成為生態學界最熱門的問題之一［36?37］。作為對植物生長發育和土壤環境保護具有重要作用的一類有益微生物，AM 真菌在青藏高原地區的分布格局及驅動機制已得到廣泛研究［25，38?39］，然而這些研究仍停留在描述性階段，很少涉及機理探求。

本研究以三江源國家公園高寒荒漠、高寒草原、高寒草甸和高寒濕地4 種典型草地生態系統為研究對象，通過分析不同生態系統中AM 真菌群落的物種及譜系組成，并結合群落譜系分析方法，探究高寒草地生態系統中AM 真菌群落變化的關鍵驅動過程，以探明影響AM 真菌群落組成的各種因素以及預測生態系統的可持續性。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本研究區域位于三江源國家公園，地處青藏高原腹地，是長江、黃河、瀾滄江的發源地，素有“中華水塔”、“亞洲水塔”之稱。該區域屬于典型的高原大陸性氣候，表現為冷熱兩季交替，干濕兩季分明，年溫差小，日溫差大，日照時間長，輻射強烈，無四季區分的氣候特征。牧草生長期不足3 個月，無絕對無霜期。三江源國家公園地處青藏高原高寒草甸區向高寒荒漠區的過渡區，從東南向西北分布著高山灌叢、高寒草甸、高寒草原、高寒荒漠以及沼澤濕地組成的高寒生態系統。土壤質地粗，以高山草甸土為主。

1.2 采樣地點及方法

2017 年8 月，本研究選擇高寒荒漠、草原、草甸和濕地4 種典型草地生態系統分別進行取樣，其中高寒草甸（34°59′45″N，94°29′42″E，4370 m）和高寒濕地（34°59′36″N，94°29′20″E，4370 m）位于曲麻河鄉附近，優勢植物分別為小嵩草（Kobresia humilis）和藏嵩草（Kobresia tibetica）。高寒草原（35°01′14″N，97°18′57″E，4309 m）采樣點位于瑪多縣，優勢植物為紫花針茅（Stipa purpurea）。高寒荒漠（35°27′36″N，93°28′36″E，4460 m）采樣點位于治多縣可可西里自然保護區內。在高寒荒漠、草原和草甸3 個采樣點，分別采用“十”字樣線法，每隔10 m 設點，間隔采集13 個點。基于草地群落空間異質性特征分析，在高寒濕地每隔10 m 設點，間隔采集了10 個點。在每個點設置1 m×1 m 的樣方，對植被組成、蓋度和高度等進行調查統計，同時采集0～10 cm 表層土壤，過2 mm篩后分別風干和冷凍保存。

1.3 土壤理化指標測定

土壤pH 值用1∶2.5（w/v）的土水比，復合玻璃電極檢測［40］。采用烘干法測定土壤含水量（soil water content，SWC）［40］。采用外加熱重鉻酸鉀容量法［41］測定土壤有機碳（soil organic carbon，SOC）含量，采用凱氏定氮法［42］測定土壤全氮（soil total nitrogen，TN）。土壤可溶性有機碳（soil dissolved organic carbon，DOC）的測定則采用冷水浸提法（土水比為1∶5，震蕩過夜），用TOC 分析儀（Liqui TOC II；Elementar Analysensysteme GmbH，Hanau，德國）進行測定［40］。NaHCO3浸提?鉬銻抗比色法測土壤有效磷（soil available phosphorus，AP）［43］含量。NO3-N 和NH4-N 的測定采用2 mol·L?1KCl 浸提后經流動分析儀（TRAACS 2000）進行測定［40］，其中土壤有效氮（soil available nitrogen，AN）為NO3-N 和NH4-N 之和。

1.4 AM 真菌群落的分子分析

每個樣品稱取0.5 g 凍存的鮮土，采用MoBio Power Soil?DNA Isolation 試劑盒提取土壤總DNA。初提DNA 用ddH2O 稀釋10 倍后用作巢式PCR 擴增的模板。第一輪PCR 的引物為GeoA2-AML2，采用25 μL 反應體系，其中包括模板2 μL，引物各1 μL（10 μmol·L?1），按照Taq PCR Kit（Tiangen Biotech）說明書進行PCR 反應。擴增程序為：94 ℃3 min，30×（94 ℃30 s，48 ℃1 min，72 ℃3 min），72 ℃10 min。第一次PCR 產物稀釋100 倍之后作為第二次PCR 的模板，引物采用AMV4.5NF-AMDGR，采用50 μL 反應體系。擴增程序為：94 ℃3 min，35×（94 ℃45 s，53 ℃45 s，72 ℃45 s），72 ℃10 min。兩次產物均采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物經純化后進行Illumina-Miseq 高通量測序。

對于得到的雙端序列數據，首先利用FastQC 軟件對序列的數量和質量進行評價，然后利用Perl 腳本進行前期質量控制，去掉3’端低質量堿基以及含N 的reads，滑窗50 平均質量低于20 且長度小于200 bp 的reads。利用Flash 將兩端reads 進行拼接，overlap 最小長度設為20 bp，最大為250 bp，overlap 區允許最大錯配率為0.1。隨后對raw tags 進行過濾，條件為去掉平均質量小于25 的序列，barcode 允許錯配最大為0，最大引物錯配數為0，片段大小過濾在200 和300 bp 之間。按照97%相似性對拼接過濾后的clean tags 進行聚類，同時去除singleton OTU（operational taxonomic unit）和嵌合體。將挑選出的代表序列參考NCBI 和MaarjAM 在線數據庫進行比對，條件設置為＞97% similarity，＞90% coverage 和＞200 BLAST score value，對每個OTU 進行物種注釋。為進一步確定序列的分類，本試驗基于N-J（neighbor joining）系統發育樹的拓撲學結構，確保每條代表序列都能夠被劃分至相應的科和屬。本研究所獲得的代表序列提交至GenBank 中保存BioProject（ID：PRJNA630556）。

1.5 數據統計與分析

AM 真菌α 多樣性通過計算97%序列相似性水平的OTU 數（豐富度）、Shannon?Wiener 指數和Faith 譜系多樣性指數（phylogenetic diversity，PD）來表征。利用單因素方差分析和Tukey’s honestly 顯著差異檢驗（P＜0.05）分析不同草地類型間AM 真菌α 多樣性的差異。AM 真菌α 多樣性指數與環境因子的相關性利用Pearson相關進行檢驗。利用非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS）對植物群落和AM 真菌群落進行排序分析，計算兩兩草地類型間群落組成的Bray-Curtis 相異性指數，組間群落組成的差異性用非參數的多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PerMANOVA）來進行比較。

AM 真菌的譜系結構利用R 語言picante 包完成。評估一個群落的譜系結構與零假設的群落（及理論上完全由隨機過程構建的群落）是否顯著不同，本研究基于最近種間平均進化距離（mean nearest taxon distance，MNTD），利用“ses.mntd”函數計算了凈最近種間親緣關系指數（nearest taxon index，NTI）［44］。通過NTI 值可以推斷隨機過程和基于生態位機制的生態過程在驅動群落裝配中的相對重要性。一般而言，當基于所有群落樣本NTI 值的平均值顯著＞0，表明群落在譜系結構上為聚集，＜0 為譜系發散，而與0 無顯著差異則表明群落譜系結構是隨機的。NTI 值和0 期望值之間的顯著差異是由雙尾單樣本t檢驗（one-samplettest）在95%的置信水平上確定的。為表征AM 真菌群落的演替，本研究基于βMNTD 計算了βNTI，當βNTI＜?2 或＞+2 時，表示試驗群落與零模型間存在顯著差異，確定性過程（同質性選擇及異質性選擇）是推動群落演替的主導因素；反之，|βNTI|＜2 時，試驗群落與零模型間無顯著差異，隨機擴散（同質性擴散及擴散限制）以及漂移、多樣化是推動群落演替的主導因素［44?45］。

AM 真菌群落與植物和土壤環境因子之間的相關性通過Mantel test 確定。本研究利用方差分解分析（variation partition analysis，VPA）來評估不同草地類型間植物和土壤環境變量對AM 真菌群落構成影響的相對貢獻，其中，用于方差分解分析只能是通過因子預選（冗余分析redundancy analysis）被證明與AM 真菌群落相關的因子。最后，本研究通過Amos 5.0 構建結構方程模型用以分析草地類型如何直接或間接地影響AM 真菌群落組成，其中植物群落和AM 真菌群落組成采用相應的PCA 一軸上的得分值來表征。該模型擬合度的參考標準是：chi-square/df＜2，P＞0.05；近似誤差均方根（root mean square error of approximation，RMSEA）＜0.05；擬合優度指數（goodness of fit index，GFI）＞0.99［46］。

2 結果與分析

2.1 植物和土壤環境因子的變異性

在4 種草地類型之間，除土壤pH 之外，其他環境因子均表現出較強的變異性，其中土壤有機碳含量（SOC）、土壤含水量（SWC）、土壤全氮（TN）、有效氮（AN）含量和土壤有效氮磷比（N∶P）變異性均在60% 以上，其次是有效磷（AP）、可溶性有機碳（DOC）、全磷（TP）含量以及植物豐富度的變異性也都在20%以上（表1）。NMDS 排序分析表明，不同草地類型間植物群落組成均存在顯著差異（F=31.74，P=0.001；圖1）。

圖1 不同草地類型間植物群落組成的NMDS 排序Fig.1 NMDS ordination of plant community composition（Bray-Curtis distance）among different grassland types

表1 植物和土壤環境因子的變異性Table 1 Variability of plant and soil environmental factors

2.2 AM 真菌多樣性及群落組成

本研究共檢測到379 個AM 真菌OTU，分別歸屬于10 個屬，其中優勢屬為球囊霉屬（Glomus）［47］，占所有序列數的44.08%，其次是多樣孢囊霉屬（Diversispora）（26.37%）和近明球囊霉屬（Claroideoglomus）（25.12%）。AM 真菌各屬的相對豐度在4 種草地類型間存在明顯差異（圖2A），其中球囊霉屬在高寒荒漠、高寒草甸和高寒濕地的相對豐度均顯著高于高寒草原，而多樣孢囊霉屬在高寒草原的相對豐度則顯著高于另外3 種草地類型，高寒荒漠近明球囊霉屬的相對豐度則顯著低于另外3 種草地類型（圖2B）。

圖2 AM 真菌屬水平上在各草地類型的相對豐度［48］Fig.2 Relative abundance of AM fungi in various grassland types at the level of genus

高寒濕地AM 真菌的OTU 豐富度和譜系多樣性指數均顯著低于其他3 種草地類型，Shannon?Wiener 指數在4 種草地類型間則無顯著差異（表2）。與NMDS 排序分析結果一致（圖3），非參數的多元方差分析（Per-MANOVA）表明AM 真菌群落物種組成（F=5.61，P=0.001）和譜系組成（F=4.69，P=0.001）在不同草地類型間均存在顯著差異（表3）。

表2 不同草地類型間AM 真菌α 多樣性指數的差異Table 2 Differences in α diversity index of AM fungi among different grassland types

圖3 AM 真菌群落（A）物種組成（Bray-Curtis distance）和（B）譜系組成（Weighted-UniFrac）的NMDS 排序Fig.3 NMDS ordination of AM fungal community（A）species composition（Bray-Curtis distance）and（B）phylogenetic composition（Weighted-UniFrac）

譜系分析結果顯示（圖4），NTI［48］（最近親緣指數）在4 種草地類型內均顯著為正，表明在三江源地區典型高寒草地生態系統中，AM 真菌群落高度聚集。高寒荒漠的βNTI 均在?2 和+2 之間，而在高寒草原、高寒草甸和高寒濕地生態系統中，盡管大部分βNTI仍在?2 和+2 之間，但是在高寒草原（8.97%），βNTI＞2 的比例增加，而在高寒草甸（29.49%）和高寒濕地（22.22%），βNTI＜?2 的比例增加。

2.3 AM 真菌群落構成的影響因素

相關分析顯示（表4），AM 真菌OTU 豐富度、香農?威納指數以及譜系多樣性指數均與土壤有效N∶P存在顯著的負相關關系，OTU 豐富度和譜系多樣性指數均與植物多樣性（豐富度、香農?威納指數）呈顯著正相關，而與土壤含水量呈顯著負相關。Mantel test 分析結果顯示（表5），AM 真菌群落物種和譜系組成與土壤含水量的相關性最高，其次是土壤有效N∶P。植物多樣性與AM 真菌物種組成顯著相關，與AM 真菌群落譜系組成無顯著相關關系。方差分解結果顯示，地上植物群落組成、土壤含水量以及土壤有效N∶P 能夠解釋14%的AM 真菌群落物種組成（圖5A）和31%的譜系組成（圖5B）。其中，植物群落組成所解釋的方差比例最大，其次是土壤含水量。

表3 不同草地類型間AM 真菌群落組成的PerMANOVA 分析［48］Table 3 PerMANOVA analysis of AM fungal community composition among different grassland types

圖4 不同草地類型AM 真菌群落的NTI 和βNTIFig.4 NTI and βNTI of AM fungal communities in different grassland types

表4 AM 真菌α 多樣性指數與環境因子的相關性Table 4 Correlation between α diversity index of AM fungi and environmental factors

表5 AM 真菌群落組成與環境因子的Mantel test 分析Table 5 Mantel test analysis of AM fungal community composition and environmental factors

結構方程模型（structural equation model，SEM）揭示了不同草地類型下AM 真菌群落構成的直接和間接影響途徑（圖6）。模型可解釋54%的AM 真菌群落物種組成和33%的譜系組成的變化。整體來看，土壤含水量是AM 真菌群落物種組成的首要決定因素，其次是草地類型和植物群落組成的差異；而植物群落組成是決定AM 真菌群落譜系組成的關鍵因子，土壤含水量和土壤有效N∶P 則次之。

圖5 植物群落組成、土壤含水量和土壤有效N∶P 對（A）AM 真菌群落物種組成及（B）譜系組成的貢獻率Fig.5 Contribution rate of plant community composition，soil water content and soil available N∶P to（A）AM fungal virtual taxon composition and（B）phylogenetic composition

圖6 草地類型、植物群落組成、土壤含水量和土壤有效N∶P 對AM 真菌群落物種組成和譜系組成影響的因果關系路徑，以及每個因子對AM 真菌群落影響的標準化總效應系數（直接路徑+間接路徑）Fig.6 The structural equation model shows the causal path of the effects of grassland type，plant community composition，soil water content and soil available N∶P on AM fungal virtual taxon composition and phylogenetic composition，and the standardized total effect coefficient（direct path+indirect path）of each factor on AM fungal community

3 討論

3.1 不同高寒草地生態系統中AM 真菌多樣性的比較

本研究基于土壤DNA 分析，比較了三江源地區4 種典型高寒草地生態系統的AM 真菌多樣性。研究發現，AM 真菌群落的物種組成和譜系組成在不同草地類型間均存在顯著差異，其中，高寒荒漠、高寒草原和高寒草甸的AM 真菌多樣性均高于高寒濕地。這說明相比于陸地生態系統，接近厭氧環境的濕地生態系統在很大程度上限制了AM 真菌的發育以及與濕地植物的共生［49］。與以往研究結果類似，適應性強、分布廣泛的球囊霉屬是本研究中高寒濕地的優勢屬，同時也是高寒荒漠和高寒草甸的優勢屬［50］。球囊霉科的AM 真菌能夠通過它們的菌絲或者侵染的根段侵染新的宿主植物，比其他種類的AM 真菌有更高的繁殖速率和強度，因此，球囊霉屬在很大程度上影響并決定了不同草地類型的AM 真菌的物種多樣性。在4 種草地類型中，隨著土壤含水量的增加，土壤碳、氮、磷等養分含量均呈現增加的趨勢，土壤pH 值則呈現下降的趨勢，與之對應的近明球囊霉屬的相對豐度也呈現增加的趨勢，并且與土壤養分指標均呈顯著正相關，而與土壤pH 值則呈顯著負相關。這說明水肥條件的改善更利于近明球囊霉屬的生長發育。而在高寒草原生態系統中，多樣孢囊霉屬的相對豐度增加并成為該草地類型的優勢屬，這意味著以產大孢子、多菌絲為主的多樣孢囊霉屬在高寒草原的競爭能力更強，還是受到宿主特異性調控？這些問題需要進一步研究。

3.2 AM 真菌群落組成的驅動因素及相關生態過程

許多研究認為，植物多樣性對AM 真菌群落的構建具有重要作用［27，51?52］。雖然本研究的對象是土壤內的AM真菌，而非植物根系，仍然檢測到宿主植物能夠顯著影響AM 真菌的分布。本研究發現，AM 真菌物種豐富度和系統發育多樣性均與植物多樣性呈顯著正相關，說明在自然生態系統中，多樣性高的植物群落具有為AM 真菌提供更多樣的生態位和棲息地的條件，從而增加了AM 真菌找到更合適的宿主植物的機會［53?55］。同時，本研究基于植物群落高度變異的分析，證實了在區域尺度上植物群落組成是AM 真菌群落空間分布最為重要的影響因素，說明植物更傾向將光合產物提供給能夠為其生長提供更多幫助的AM 真菌類群［56］。然而，AM 真菌與植物之間的決定關系也并非一成不變，在共生體系的建立過程中，特定條件下AM 真菌及其宿主的功能特性在一定程度上決定了AM 真菌與宿主植物之間的相互選擇，找到最適合的宿主植物可能是AM 真菌?植物協同進化的重要原因［57?58］。并且，AM 真菌物種之間存在明顯的功能互補效應，豐富的AM 真菌種類可幫助植物更能充分地獲取有限的養分資源，從而緩解植物之間的競爭，促進植物之間的共存［59?60］。此外，非菌根植物的存在（尤其是在濕地生態系統）也會在一定程度上抑制AM 真菌侵染植物根系，從而降低AM 真菌豐富度［61］。

本研究中，土壤水分和有效N∶P 是影響AM 真菌群落組成的另外兩個關鍵因素，表明地下資源有效性對AM真菌具有重要的調控作用。土壤水分可直接影響AM 真菌侵染率［62］、根外菌絲的生長和分布［63］以及特定種的AM 真菌構建進而影響AM 真菌群落的構建［64］，同時，AM 真菌對氧氣有相對較高的需求［65］，土壤的通氣狀況在很大程度上會影響AM 真菌的生長發育及其多樣性，這也就解釋了本研究在高含水量和可能缺氧的濕地生態系統中發現了較低的AM 真菌多樣性。此外，如前所述，植物群落組成是影響AM 真菌的重要因素，而土壤水分變化可間接通過改變地上植物群落構成、多樣性以及生產力等來影響AM 真菌［25，66?67］。地面植物群落從改變組成、多樣性、生產力等方面影響AM 真菌。除水分外，土壤氮磷資源均是植物及其共生AM 真菌的必須礦質元素，土壤氮磷養分水平和氮磷的化學計量比決定了AM 真菌與植物的共生關系［68?69］。低水平的氮磷有效性是AM 真菌?植物互惠共生關系的重要前提，但是過低/高的氮磷水平又會直接限制AM 真菌的生長，當氮和磷均不是限制因子時，AM 真菌與植物競爭光合產物，又會抑制植物生長［70］。本研究中，土壤有效氮磷化學計量比與AM 真菌多樣性呈顯著負相關，尤其對AM 真菌群落的譜系組成影響更大，暗示了土壤氮磷的平衡性可能對AM 真菌群落構建有著重要作用。而且土壤N、P 資源的可利用性對植物的生長發育、物種多樣性和群落結構等均具有顯著的調控作用［23，68，70?71］，這些變化也會引起AM 真菌群落結構和功能變化。

本研究中AM 真菌群落在4 種高寒草地生態系統中均為譜系聚集模式，表明在自然生態系統中AM 真菌物種間的親緣關系均較近［24，72］。基于βNTI 結果則發現，隨機過程（同質性擴散）是決定高寒荒漠生態系統AM 真菌群落構建的主要過程，而在另外3 種草地類型中，AM 真菌群落構建均以隨機過程為主導、伴隨確定性過程微弱的影響。并且高寒草原的植物群落和土壤環境條件異質性比較大（斑塊化），AM 真菌群落間的差異逐漸增大，受環境異質性選擇的主導。而對于高寒草甸和高寒濕地，植物和土壤環境條件相對均勻，AM 真菌群落間的差異逐漸縮小，受環境同質性選擇主導。

4 結論

綜上所述，基于Illumina-Miseq 高通量測序手段，本研究揭示了青藏高原高寒草地生態系統AM 真菌多樣性和群落組成及其相關生態過程。AM 真菌多樣性和群落結構在4 種草地類型間存在明顯差異，其中植物群落組成、土壤含水量和有效N∶P 是關鍵的影響因子。AM 真菌群落的譜系結構均為聚集模式，在高寒荒漠，AM 真菌群落構建由隨機過程決定，而在高寒草原、高寒草甸和高寒濕地，AM 真菌群落受隨機過程以及微弱的環境選擇作用主導。