外源褪黑素對干旱脅迫下煙草幼苗光合碳同化和內源激素的影響

李冬，申洪濤，王艷芳，王悅華，王麗君，趙世民，劉領*

（1.河南科技大學農學院，河南 洛陽471023；2.貴州省煙草公司黔東南州公司，貴州 凱里556000；3.河南中煙工業有限責任公司技術中心，河南 鄭州450000；4.河南省煙草公司洛陽市公司技術中心，河南 洛陽471023）

近年來，隨著全球氣候變暖和環境的惡化，干旱強度、頻率及持續時間不斷增加，加之我國降水季節和地域性降水分布極不均勻，水資源匱乏日趨嚴重，干旱已成為影響植物正常生長發育的重要限制因子［1?2］。已有研究表明，干旱脅迫會導致植物生理代謝受到抑制，內源激素間平衡遭到破壞，葉片氣孔關閉，光系統Ⅱ反應中心受到損傷，光化學反應能力下降，體內光能過剩，植物葉綠體結構受到破壞，光合碳同化受阻，碳水化合物含量發生變化，進而導致植物生長緩慢、萎蔫甚至死亡［3?6］。煙草（Nicotiana tabacum）是對干旱十分敏感的經濟作物之一，煙草幼苗田間生長前期若無法得到充足的水分進行緩苗伸根，將會因干旱脅迫而產生生理障礙，嚴重影響生產后期煙葉的產量和品質［7?8］。因此，研究利用外源物質減輕干旱脅迫對煙草幼苗的損傷，增強煙草幼苗的抗旱性，對促進煙農增收、實現煙區可持續發展具有重要的現實意義。

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺，melatonin，MT，C13H16N2O2）是一種兼親水性與親脂性的吲哚類激素物質，廣泛存在于生物體內［9］。隨著植物體內褪黑素生物合成等的深入研究，褪黑素的生理功能及機理研究已成為國內外學者關注的重點，褪黑素作為一種新型的生物調節因子，具有促進植物根系生長，激活活性氧清除系統，延緩葉片衰老，調節光周期，參與光合色素的生物合成，促進光合作用，增強植物抗逆性等生理功能［10?14］。李本峰等［15］的研究表明，外源褪黑素能提高干旱脅迫下多年生黑麥草（Lolium perenne）的代謝產物積累量，增強其滲透調節和抗氧化能力，提高光化學效率，進而增強多年生黑麥草的抗旱能力。Liang 等［16］研究表明，外源褪黑素可以通過促進獼猴桃（Actinidia chinensis）幼苗根系結構的發育，降低脂質過氧化和色素降解，減輕細胞膜損傷，促進滲透積累，抑制或促進某些蛋白的降解或合成，抑制氣孔關閉、提高光能吸收、促進PSⅡ中的電子傳遞來促進光合作用，從而增強幼苗對干旱脅迫的適應性。Gao 等［17］以燕麥（Avena sativa）為材料，通過PEG?6000 模擬干旱，研究發現外源MT 能夠提高燕麥幼苗葉片抗氧化酶活性，調控抗氧化相關基因的表達水平，從而提高植物的抗旱性。

目前，外源MT 在提高植物抗逆性上的研究已有大量報道，且在煙草中也有研究，但是關于MT 對干旱脅迫下煙草幼苗內源激素和碳水化合物代謝方面的研究卻鮮見報道。因此，本試驗以不同抗旱性的煙草幼苗為材料，研究干旱脅迫下MT 對煙草幼苗生長、葉綠素熒光特性、光合碳同化酶、碳水化合物和內源激素代謝的影響，以期揭示MT 在緩解植物干旱脅迫作用中的內在機制，為利用MT 緩解農業生產上常遇到的干旱問題提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為‘豫煙6 號’（耐旱型）和‘豫煙10 號’（干旱敏感型），種子由河南省洛陽市煙草公司提供，褪黑素（MT）購自美國Sigma 公司。

1.2 試驗設計

試驗于2019 年5 月在洛陽市河南科技大學旱作與節水生理生態重點實驗室開展，供試種子用10%（V·V?1）H2O2表面消毒，蒸餾水沖洗后浸種，在育苗盤中發芽，以蛭石作為基質，放入人工氣候培養箱中培養。培養條件設置為光周期14 h/10 h（晝/夜），晝/夜溫度（28±2）/（20±2）℃，光照強度4000 lx。當煙草幼苗真葉生長至8～9片時，選取形態長勢基本一致的煙草幼苗，定植于裝土5.00 kg 的塑料盆中（上口徑25 cm，下口徑10 cm，高17 cm），每盆定植1 株。供試土壤取自校園農場試驗田0～20 cm 表層土，土壤為黃潮土，質地為中壤，土壤容重1.35 g·cm?3，有 機 質10.72 g·kg?1，堿解氮33.86 mg·kg?1，速 效 磷3.46 mg·kg?1，速 效 鉀123.54 mg·kg?1，土壤pH 7.56，田間持水量為31.8%，煙草幼苗移栽于塑料盆后緩苗1 周，以保證煙草幼苗的正常生長，待緩苗結束后，進行試驗處理。

試驗共設4 個處理，CK：正常供水+葉片噴施蒸餾水；MT：正常供水+葉片噴施0.2 mmol·L?1的褪黑素；MD：中度干旱+葉片噴施蒸餾水；MD+MT：中度干旱+葉片噴施0.2 mmol·L?1的褪黑素，每個處理4 個重復。正常供水和干旱處理，分別為田間持水量的75%～80%（正常水分）和50%～55%（中度干旱），干旱處理同時在煙草幼苗葉片正反兩面均勻噴施MT 溶液或蒸餾水，每2 d 噴施一次，連續噴施3 次，噴施程度以葉面濕潤無滴水為宜，MT 噴施濃度及次數均由前期試驗所確定，試驗期間于每天18：00 采用稱重法，計算并補充當天耗散的水分，使各處理土壤含水量保持設定的范圍內。于干旱脅迫處理30 d 后取煙草幼苗自上而下第3 片真葉進行各項生理指標的測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生長指標測定 處理結束后用直尺測量株高（莖基部到生長點的距離），游標卡尺測量莖粗（子葉下部的直徑）。將煙草植株的莖葉與根系分開洗凈（自來水沖洗3 次，蒸餾水沖洗2 次，用吸水紙吸干）后，稱量地上部和地下部鮮重，然后放入烘箱中于105 ℃下殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，稱量地上部和地下部干重，根冠比=地下部干重/地上部干重。

1.3.2 葉綠素熒光參數測定 采用MINI-PAM 便攜式調制熒光儀（Walz，德國）測定葉綠素熒光參數。測定前先對葉片進行30 min 暗適應，測得初始熒光（minimal fluorescence，Fo）、最大熒光（maximal fluorescence，Fm）、穩態熒光（steady-state fluorescence，Fs）、光下最大熒光（Fm′），光下最小熒光（minimal fluorescence under light，Fo′）。PSⅡ最大光化學效率（maximum photochemical efficiency，Fv/Fm）＝（Fm?Fo）/Fm，實際光化學效率（actual photochemical efficiency of PSⅡ，ΦPSⅡ）＝（Fm′?Fs）/Fm′，光化學猝滅系數（photochemical quenching，qP）＝（Fm′?Fs）/（Fm′?Fo′）和非光化學猝滅系數（none photochemical quenching，NPQ）＝Fm/Fm′?1。

1.3.3 光合碳同化酶活性測定 景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（sedoheptulose-1，7-bisphosphatase，SBPase）和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase，Rubisco）按試劑盒說明檢測，用酶標儀（Thermo Multiskan GO，美國）測定450 nm 波長的吸光值，計算其濃度，酶活性單位以U·g?1鮮重表示。所用試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3.4 內源激素含量測定 剪取煙草幼苗自上而下第3 片真葉，稱取0.5 g，采用酶聯免疫吸附分析法（ELISA）［18］測定內源激素：生長素（auxin，IAA）、赤霉素（gibberellins，GA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）和玉米素核苷（zeatin riboside，ZR）含量。所用試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3.5 碳水化合物測定 可溶性總糖、蔗糖、果糖及淀粉含量均按照南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 22.0 軟件進行數據處理和分析，Origin 9.0 軟件進行繪圖，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較，所有數據均為4 個重復的平均值±標準誤（mean±SE）。

2 結果與分析

2.1 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗生長的影響

與CK 相比，MD 處理下Y10 品種的株高、莖粗、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重和地下部干重分別降低了35.80%、16.05%、74.45%、66.38%、73.38%和65.22%，根冠比提高了29.41%；Y6 品種的株高、莖粗、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重和地下部干重分別比CK 降低了21.25%、13.51%、55.61%、51.16%、50.79%和37.31%，根冠比提高了28.57%，差異均達顯著水平（表1）。這表明中度干旱顯著影響了兩煙草品種的幼苗生長，且干旱敏感型Y10 品種受到的影響大于耐旱型Y6 品種。

與CK 相比，MT 處理下Y10 品種株高、地上部鮮重和地上部干重分別增加了10.85%、9.58%和8.96%，Y6品種株高、地上部鮮重和地上部干重分別增加了1.47%、13.45%和5.40%，兩煙草品種的莖粗、地下部生物量和根冠比差異均未達顯著水平。與MD 處理相比，MD+MT 處理下Y10 品種的株高、莖粗、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重和地下部干重分別提高了22.30%、12.31%、68.10%、51.95%、31.61%和50.00%，根冠比降低了13.64%；Y6 品種的株高、莖粗、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、地下部干重分別提高了3.08%、6.25%、46.46%、33.63%、77.57%和26.19%，根冠比降低了3.70%，說明外源MT 對干旱敏感型烤煙品種Y10的作用效果更明顯。

表1 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗生長的影響Table 1 Effects of exogenous MT on the growth of tobacco seedlings under drought stress

2.2 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片葉綠素熒光參數的影響

與CK 相比，MD 處理下Y10 品種的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP 分別降低了4.24%、24.95%和23.49%，NPQ 升高了64.07%；Y6 品種的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP 分別比CK 降低了2.59%、8.11%和15.25%，NPQ 升高了25.92%，差異均達顯著水平，且Y10 品種變化幅度大于Y6 品種（表2）。在正常生長條件下，MT 處理對兩煙草品種幼苗葉綠素熒光參數無顯著影響。與MD 處理相比，MD+MT 處理下Y10 品種的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP 分別提高了3.23%、16.44% 和20.06%，NPQ 降 低 了18.60%；Y6 品 種 的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP 分 別 比MD 提 高 了2.41%、7.80% 和10.32%，NPQ 降低了15.05%。

2.3 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片光合碳同化酶活性的影響

與CK 相比，MD 處理下兩煙草品種幼苗的SBPase 和Rubisco 活性均顯著降低，Y10 品種的SBPase 和Rubisco 活性分別降低了26.95%和38.37%；Y6 品種的SBPase 和Rubisco 活性分別降低了18.29%和26.51%（圖1）。在正常生長條件下，MT 處理下煙草幼苗葉片光合碳同化酶活性雖然均有不同程度的提高，但差異未達顯著水平。與MD 處理相比，MD+MT 處理下Y10 品種的SBPase 和Rubisco 活性分別提高了15.41%和25.08%，Y6品種的SBPase 和Rubisco 活性分別提高了7.19%和14.70%，其中Y10 品種的增幅明顯高于Y6 品種。

表2 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片葉綠素熒光參數的影響Table 2 Effect of exogenous MT on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of tobacco seedlings under drought stress

圖1 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片光合碳同化酶活性的影響Fig.1 Effects of exogenous MT on photosynthetic carbon assimilation enzyme activity in leaves of tobacco seedlings under drought stress

2.4 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片碳水化合物的影響

與CK 相比，MD 處理下Y10 的可溶性總糖、蔗糖和果糖含量均顯著升高，淀粉含量顯著降低，Y6 的可溶性總糖、蔗糖和果糖含量均顯著升高，淀粉含量略有降低（圖2）。在正常生長條件下，MT 處理能提高煙草幼苗葉片內可溶性總糖和淀粉的含量，但對蔗糖和果糖含量無明顯影響。與MD 處理相比，MD+MT 處理下Y10 品種的可溶性總糖、蔗糖和果糖含量分別提高了38.55%、29.17%和35.19%，淀粉含量降低了21.65%；Y6 品種的可溶性總糖、蔗糖和果糖含量分別提高了1.37%、13.63%和36.32%，淀粉含量降低了3.30%。

2.5 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片內源激素的影響

與CK 相比，MD 處理下兩煙草品種幼苗葉片的IAA、GA 和ZR 含量均顯著降低，ABA 含量均顯著提高，Y10品種的IAA、GA 和ZR 含量分別降低了41.89%、21.92%和37.01%，ABA 提高了31.20%；Y6 品種的IAA、GA和ZR 含量分別降低了43.64%、19.48%和14.81%，ABA 含量提高了41.86%（圖3）。在正常生長條件下，MT處理對煙草幼苗葉片內源激素含量無顯著影響。與MD 處理相比，MD+MT 處理下Y10 品種的IAA、GA 和ZR含量分別提高了37.30%、19.89%和37.24%，ABA 含量降低了13.15%；Y6 品種的IAA、GA 和ZR 含量分別比MD 提高了47.86%、14.57%和9.38%，ABA 含量降低了16.63%。

3 討論

圖2 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片碳水化合物含量的影響Fig.2 Effects of exogenous MT on carbohydrates content in leaves of tobacco seedlings under drought stress

圖3 外源MT 對干旱脅迫下煙草幼苗葉片內源激素含量的影響Fig.3 Effects of exogenous MT on endogenous hormones content in leaves of tobacco seedlings under drought stress

生物量積累與植株形態指標的變化是植物響應干旱脅迫最直接的表現，在逆境脅迫下，植物往往會通過調整生物量的分配和形態特征，如降低株高、減小葉面積及增加根冠比等策略來維持自身的生長發育［19?20］。本研究結果表明，干旱脅迫下，兩煙草品種幼苗根冠比增加，生長發育均受到明顯抑制。噴施外源MT 提高了干旱脅迫下兩煙草品種幼苗的株高、莖粗和生物量，降低了根冠比，說明外源MT 對干旱脅迫下植物生長策略的改變具有一定的解除作用，有效地緩解了干旱脅迫下對煙草幼苗生長的抑制作用。葉君等［21］在小麥（Triticum aestivum）上的研究發現，根施褪黑素能顯著增加干旱脅迫下小麥幼苗的根冠比，這與本研究結果不一致，可能與褪黑素施用方式及作物生長習性不同有關。

葉綠素熒光參數是反映植物對光能的吸收、轉化、傳遞、分配情況的靈敏探針，能夠反映逆境因子對植物光合生理狀況的損傷程度［22?23］。Fv/Fm是植物葉片PSⅡ的最大光化學量子產量，反映了植物潛在的最大光合能力，ФPSII反映了PSⅡ反應中心在有部分關閉情況下的實際原初光能轉化效率，qP 反映了PSⅡ反應中心開放的比例，代表了光化學電子轉移所使用的能量，NPQ 反映了PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分［24?27］。本研究結果顯示，干旱脅迫下煙草幼苗葉片的Fv/Fm、ФPSII和qP 顯著下降，NPQ 顯著升高，表明在干旱脅迫下煙草幼苗的光系統Ⅱ中心受到不同程度的損傷，光化學活性和潛在的光合能力受抑制，光合電子傳遞能力下降，光能利用率降低，光能過剩加劇了對葉片光合的抑制和光合器官的傷害，CO2同化能力下降，降低了碳同化的運轉和有機物的積累，導致煙草幼苗生長受到抑制，這與前人的研究結論一致［28?29］。在本研究中，干旱脅迫下施用外源MT 后兩煙草品種幼苗的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP 均顯著增加，NPQ 明顯降低。表明外源MT 能夠增加干旱脅迫下煙草幼苗光系統反應中心的光化學活性，保護PSⅡ免受過多能量的損傷，增強光合系統反應中心的穩定性，促進光合碳同化能力的增強，緩解干旱脅迫對煙草幼苗造成的光抑制。

在卡爾文循環中Rubisco 是同化CO2的限速酶，其活性的高低和基因的表達可決定植物光合效率和碳水化合物的積累量，SBPase 參與光合作用中還原型磷酸戊糖循環，在卡爾文循環過程中控制著碳的流入和再生［30?32］。本試驗結果表明，干旱脅迫下兩煙草品種幼苗葉片的SBPase 和Rubisco 活性均顯著下降。干旱脅迫下噴施MT后，兩煙草品種幼苗葉片的SBPase 和Rubisco 活性均顯著提高，說明干旱脅迫下噴施外源MT 能在一定程度上減輕干旱脅迫對光合暗反應的抑制，有利于光合碳同化能力的提高，加速卡爾文循環的運轉，保護光合系統，促進光合磷酸化和NADPH 的合成。碳水化合物是植物光合碳同化過程中形成的基礎代謝物質和最主要的滲透調節物質，主要包括可溶性總糖、蔗糖、果糖和淀粉，與植物的生存策略密切相關，不僅在植物逆境脅迫和維持正常生命活動中發揮重要作用，而且還作為能量供應和代謝信號分子，調節抗旱相關基因的轉錄水平［33?35］。本研究結果表明，干旱脅迫下煙草幼苗葉片的可溶性總糖、蔗糖和果糖含量均顯著增加，淀粉含量顯著降低，說明干旱脅迫下葉片氣孔關閉，光合作用下降，為保證呼吸作用，煙草幼苗會通過促進葉片內的淀粉向可溶性總糖轉化，以調節體內細胞的滲透勢和水分平衡，維持正常的生理活動來適應干旱環境［36］。噴施外源MT 能夠提高干旱脅迫下兩煙草品種幼苗葉片的可溶性總糖、蔗糖和果糖含量，降低淀粉含量，說明外源MT 能調節干旱脅迫下煙草幼苗體內的碳水化合物的合成及分解，提高其代謝水平，維持細胞結構的穩定，從而加強光合磷酸化而促進葉綠體光合碳同化，保持光合活性。

植物內源激素是植物體生長發育的重要調節物質，也是植物對不同逆境產生響應的激素信號分子，廣泛參與了逆境等各種生理過程的調節［37］。在正常情況下，各種激素維持在一定的平衡狀態以保證植物正常新陳代謝和生長發育，一旦遭受外界不利環境脅迫，植物就會通過改變體內激素含量來調節自身的生理機能和生長節律［38］。本研究中，干旱脅迫下兩煙草品種幼苗葉片的IAA、GA 和ZR 含量均顯著下降，ABA 含量顯著上升，且耐旱型品種的變化幅度小于干旱敏感型品種，這與張海燕等［4］研究干旱脅迫對甘薯（Ipomoea batatas）內源激素的影響結果一致，表明干旱脅迫會改變煙草幼苗內源激素的平衡，促使代謝強度降低，利于細胞含水量減少，促進脫落與休眠，從而抑制植物生長。干旱脅迫下噴施外源MT 可以顯著促進兩煙草品種幼苗體內內源IAA、GA 和ZR 的合成，抑制ABA 的產生，且對干旱敏感型品種‘豫煙10 號’的作用效果更顯著。說明外源MT 能夠改變干旱脅迫下植物內源激素的含量，調控植物體內源激素的代謝水平，延緩植物衰老，提高光合效率，增加光合碳同化產物的積累，緩解干旱脅迫對植物的損傷。推測其可能是由于外源MT 與IAA 同為吲哚化合物，具有相同的前體物質［39］，能通過與IAA 等植物激素相互作用，進而參與不同信號網絡的傳導與調控過程，促使各內源激素間發揮協同或拮抗作用，增強植物抗逆性相關基因的表達，從而提高自身的抗旱能力，且品種抗旱性越弱，其提升效果越顯著。

4 結論

干旱脅迫下，兩煙草品種幼苗的生長均受到不同程度的抑制作用。葉片噴施外源MT 能通過調節植物內源激素的代謝水平，緩解干旱脅迫對植物的光抑制程度，促進光合作用，增強光合碳同化能力，改善光合性能，促進碳水化合物的合成和積累，維持正常的生理代謝活動，促進地上部葉片生長，從而增強煙草幼苗的抗旱能力，且對‘豫煙10 號’的作用效果高于煙草品種‘豫煙6 號’。