合并隱匿性胰膽反流的膽囊結(jié)石電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察

張思淼，劉飛，劉波，祁春春，史力軍，李婧伊，馬躍峰，楊玉龍，劉文志

（大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001，1.膽石病微創(chuàng)外科，3.胃腸外科；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院膽石中心，上海 200120）

膽囊結(jié)石是一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)病原因與多種因素有關(guān)，隨著膽胰共同流出道理論的提出，隱匿性胰膽反流（occult pancreaticobiliary reflux，OPBR）被認(rèn)為是膽囊結(jié)石形成的重要原因[1-2]。OPBR是指在正常膽胰管合流的情況下發(fā)生的胰液向膽管反流[3]。在良性膽囊疾病中，OPBR的發(fā)生率為25.8%～84.2%[4]，且83.5%的膽囊結(jié)石存在OPBR[5]。目前認(rèn)為，膽汁淀粉酶是反映胰液向膽管反流的客觀指標(biāo)[6]，與膽囊結(jié)石的形成密切相關(guān)[7]。本研究從微觀結(jié)構(gòu)的角度推測(cè)膽囊結(jié)石形成過程，探索OPBR的成石機(jī)制，為臨床防治膽囊結(jié)石提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年9月至2020年5月大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院膽石病微創(chuàng)外科行腹腔鏡膽囊切除術(shù)（laparoscopic cholecystectomy，LC）治療的139例膽囊結(jié)石患者臨床資料，所有患者術(shù)前MRCP均顯示膽胰管匯合部無解剖異常，血清淀粉酶正常。本研究獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）血清淀粉酶正常；（2）MRCP顯示膽胰管合流正常；（3）行LC治療的膽囊結(jié)石患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急慢性胰腺炎；（2）合并肝臟疾病（脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝癌等）；（3）單純泥沙樣膽囊結(jié)石；（4）膽囊頸管內(nèi)結(jié)石；（5）肝內(nèi)膽管結(jié)石；（6）醫(yī)源性操作導(dǎo)致Oddi括約肌異?；蛟?jīng)接受過ERCP治療（如曾行腸膽吻合術(shù)，內(nèi)鏡下十二指腸括約肌切開取石術(shù)或內(nèi)鏡下胰膽分流術(shù)）；（7）合并膽胰匯合部疾病以外的其他肝膽胰疾病（如肝膽部腫瘤、膽囊腺肌增生癥、肝外膽管狹窄或擴(kuò)張等）。

1.2 研究方法

1.2.1 膽汁及結(jié)石收集：經(jīng)腹腔鏡建立人工氣腹，暴露膽囊三角后，在膽囊底部用穿刺針抽取膽囊膽汁5 mL，置入普通真空試管并在30 min內(nèi)送檢膽汁淀粉酶，測(cè)量膽汁淀粉酶水平，其余操作同LC常規(guī)。術(shù)后取出膽囊內(nèi)的結(jié)石。

1.2.2 結(jié)石觀察：用刀片切開結(jié)石，對(duì)結(jié)石橫切面及表面進(jìn)行清潔、固定、干燥后，用雙面導(dǎo)電膠固定在電鏡樣品臺(tái)上，在鍍膜儀（英國(guó)Quorum公司Q150T濺射鍍膜儀）中真空噴金鍍膜后，通過掃描電鏡（美國(guó)Quanta公司Quanta450型掃描電子顯微鏡）對(duì)結(jié)石橫切面進(jìn)行觀察。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）膽汁淀粉酶濃度升高：高于血清淀粉酶正常值上限（110 U/L）[8]。

（2）正常胰膽合流：MRCP顯示主胰管與膽總管在十二指腸壁內(nèi)匯合。

（3）隱匿性胰膽反流（OPBR）：MRCP顯示為胰膽合流正常，血清淀粉酶正常，膽汁淀粉酶濃度＞110 U/L。

（4）膽囊結(jié)石微觀特征：筆者團(tuán)隊(duì)在大連理工大學(xué)化工實(shí)驗(yàn)室?guī)椭拢Y(jié)合化工材料學(xué)的概念，對(duì)膽囊結(jié)石的微觀結(jié)構(gòu)特征制定如下評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。晶粒：構(gòu)成結(jié)石晶體的大小、形態(tài)各異的小晶體。電鏡下見板片狀、顆粒狀等。晶界：晶粒間的輪廓邊界。晶粒堆砌相對(duì)緊密（圖1）：微觀晶體呈整塊狀或類整塊狀分布，周圍可見大量類球形顆粒，再細(xì)分為兩種：①整塊狀：晶粒排列致密規(guī)整融合成塊，可見部分裂紋，不見晶粒及晶界（圖1A）；②類整塊狀：晶粒間填充物增多，晶界不清，部分晶粒連接成塊（圖1B）。晶粒堆砌相對(duì)疏松（圖2）：晶界清晰，晶粒間有較大空隙，填充物較少，只見少量類球形顆粒。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

依據(jù)膽囊膽汁淀粉酶水平，將98例膽汁淀粉酶濃度升高者（＞110 U/L）作為OPBR組，41例膽汁淀粉酶濃度正常者作為對(duì)照組。兩組年齡、性別、結(jié)石數(shù)量、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱冠心病）基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（見表1）。

表1 兩組基線資料比較

2.2 電鏡下膽囊結(jié)石微觀結(jié)構(gòu)特征

兩組結(jié)石晶粒堆砌相對(duì)緊密型和相對(duì)疏松型在兩組中均存在，故對(duì)兩組結(jié)石微觀結(jié)構(gòu)特征不作分組介紹。電鏡下觀察兩組膽囊結(jié)石由大量形態(tài)、大小各異的晶粒堆砌而成，如板片狀、顆粒狀晶粒等，周圍可見類球形顆粒。板片狀晶粒可呈層狀、放射狀、條索狀、不規(guī)則交錯(cuò)的疏松排列（圖2A），甚至晶粒間通過某些填充物進(jìn)而融合成整塊狀（圖1A）或類整塊狀（圖1B1、B2）。整塊狀堆砌呈現(xiàn)晶粒排列致密規(guī)整融合成塊，可見部分裂紋，不見晶粒及晶界（圖1A）；類整塊狀堆砌呈現(xiàn)晶粒間填充物增多，晶界不清，部分晶粒連接成塊（圖1B1、B2）。顆粒狀晶粒呈疏松的類球形（圖2B），甚至可見毛刺球形的類整塊狀分布（圖1B3）。以上特征均在兩組中出現(xiàn)。

圖1 晶粒堆砌相對(duì)緊密型的膽囊結(jié)石微觀結(jié)構(gòu)

圖2 晶粒堆砌相對(duì)疏松型的膽囊結(jié)石微觀結(jié)構(gòu)

2.3 兩組電鏡下結(jié)石微觀結(jié)構(gòu)比較

OPBR組98例中64例結(jié)石晶粒間填充物增多，微觀晶體呈整塊狀或類整塊狀分布，周圍見大量類球形顆粒，表現(xiàn)為相對(duì)緊密型；34例結(jié)石晶粒間填充物較少，有較大空隙，晶界清晰，周圍只見少量類球形顆粒，表現(xiàn)為相對(duì)疏松型。對(duì)照組41例中18例呈相對(duì)緊密型，23例呈相對(duì)疏松型。OPBR組膽囊結(jié)石晶粒堆砌緊密程度較高，且結(jié)石為相對(duì)緊密型的比率高于對(duì)照組[65.3%（64/98）vs43.9%（18/41），χ2=5.474，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

膽囊結(jié)石具有晶體特征，是膽汁中多種成分在復(fù)雜因素影響下相互作用的結(jié)果。隨著研究深入，學(xué)者們普遍認(rèn)為膽囊結(jié)石是因某種因素打破膽汁中膽固醇、磷脂、膽汁酸三者之間濃度平衡，甚至破壞了促、抗成核因子的動(dòng)態(tài)平衡，膽固醇聚集結(jié)晶，膽汁內(nèi)出現(xiàn)晶核[9-11]，每個(gè)晶核在細(xì)菌、自由基、離子等眾多復(fù)雜理化因素的影響下，逐漸成長(zhǎng)為形態(tài)及大小各異的晶粒。本研究中，膽囊結(jié)石晶粒有板片狀、顆粒狀、針桿狀等。喬鐵等[12]發(fā)現(xiàn)，晶粒間的縫隙存在一定數(shù)量的類球形顆粒（為膽紅素顆粒）。有研究表明，膽囊結(jié)石是由一定數(shù)量的晶粒通過非晶物質(zhì)填充進(jìn)而堆積而成[13]，此填充物主要由蛋白質(zhì)和膽紅素鹽組成[14]。多數(shù)研究者認(rèn)為，膽囊結(jié)石的晶體結(jié)構(gòu)較疏松且易破壞，這是采用體外振波碎石的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[15]。因此，我們大膽推測(cè)，因眾多復(fù)雜病理因素致膽汁內(nèi)促、抗成核因子等某些動(dòng)態(tài)平衡被打破，膽汁中晶核出現(xiàn)，晶粒逐漸長(zhǎng)出；膽囊內(nèi)復(fù)雜多變的環(huán)境限制晶粒進(jìn)一步生長(zhǎng)，所以晶粒主要通過蛋白質(zhì)網(wǎng)架及具有促成核作用的膽紅素鹽作為填充物，相對(duì)疏松地堆砌成多核生長(zhǎng)的結(jié)石晶體。

本研究中，OPBR組中整塊狀或類整塊狀結(jié)構(gòu)比率較對(duì)照組高，我們推測(cè)胰液中大多數(shù)酶是以酶原形式存在的，反流入膽管內(nèi)的酶原被膽汁激活后可引起較嚴(yán)重的生化破壞，如：膽固醇酯水解酶及磷脂酶A2被激活后，可分別水解膽固醇酯和卵磷脂，其產(chǎn)物中均有脂肪酸，可與鈣離子結(jié)合成脂肪酸鈣鹽，形成結(jié)石晶體的晶核[16]；同時(shí)，激活的磷脂酶A2在分解卵磷脂后可產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的溶血磷脂酰膽堿，這使膽汁中卵磷脂、膽固醇及膽鹽比例失衡，膽固醇溶解度降低而析出[17]。此外，這些激活的酶及其代謝產(chǎn)物可引起膽囊黏膜損傷并產(chǎn)生更嚴(yán)重的慢性炎癥改變[18]，膽囊黏膜損傷影響其對(duì)水和離子的重吸收，使膽汁內(nèi)黏蛋白及白蛋白等濃縮[19]，慢性的炎癥刺激使膽囊黏膜上皮細(xì)胞分泌大量黏蛋白，這為膽固醇沉積提供了結(jié)石網(wǎng)架[20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，取石后的膽囊黏膜分泌黏液增加，其黏液中糖蛋白先形成框架，使沉積其上的膽色素和膽固醇結(jié)晶成為微小結(jié)石，是取石術(shù)后復(fù)發(fā)的重要原因[21]。由此可見，OPBR可導(dǎo)致膽汁內(nèi)黏蛋白的大量分泌與濃縮，作為促成核因子的膽紅素鈣鹽聚集沉淀，兩者正是膽囊結(jié)石晶粒間填充物的主要成分，它們共同構(gòu)成結(jié)石晶粒堆砌的連接與網(wǎng)架。還有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于膽囊底部的微小結(jié)石和膽泥，可影響膽囊的收縮功能及其對(duì)膽道壓力的調(diào)節(jié)，使膽道壓力逐步降低[22]，且膽囊排出的微小結(jié)石及膽泥可間歇性阻塞膽胰共同流出道，從而加重高壓的胰液反流入膽管[6]。膽囊結(jié)石與OPBR之間相互影響，促進(jìn)結(jié)石形成與進(jìn)一步生長(zhǎng)。

膽道外科屬于腔道外科，通暢與否是分析問題的原則。研究發(fā)現(xiàn)，由于膽胰隔膜缺失或Oddi括約肌功能失調(diào)，乳頭炎等膽胰匯合部疾病隨之發(fā)生[2]。此疾病可引起膽胰共同流出道不暢，高壓的胰液反流至膽管，進(jìn)而發(fā)生OPBR，且淤積的膽汁胰液使膽道壓力升高。這一系列病理生理改變成為膽囊炎伴結(jié)石等多種膽道疾病發(fā)生的重要原因[23]。由此可見，膽道疾病多為膽胰匯合部疾病的表現(xiàn)形式[1]。由于膽胰共同通道過長(zhǎng)為OPBR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[24]，目前對(duì)于存在膽胰匯合部疾病的OPBR患者，臨床可經(jīng)十二指腸鏡行內(nèi)鏡下胰膽分流術(shù)（endoscopic pancreaticobiliary separation，EPBS）[25]，剖開乳頭括約肌而非Oddi括約肌，維持膽道密閉性，通過縮短膽胰共同流出道來解除流出道梗阻[26]。EPBS可有效減少取石術(shù)后結(jié)石的復(fù)發(fā)，并降低膽囊切除術(shù)后綜合征的發(fā)生率[2，6，27]。我們可通過掃描電鏡觀察被取出的結(jié)石，細(xì)化EPBS手術(shù)指征，對(duì)診斷OPBR、開展針對(duì)患者結(jié)石成因的個(gè)體化治療具有重要輔助意義。

本研究將未行ERCP、EST、膽腸吻合等術(shù)式的膽囊結(jié)石患者作為研究對(duì)象，以排除腸膽反流對(duì)研究結(jié)果的影響。取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，取出的膽汁含大量泥沙樣結(jié)石的樣本，通常膽汁淀粉酶濃度較高，病程較長(zhǎng)。此發(fā)現(xiàn)與上述隱匿性胰膽反流成石機(jī)制相符。本研究中兩組結(jié)石均出現(xiàn)晶粒堆砌相對(duì)緊密與疏松的結(jié)構(gòu)特征，這可能與膽道壓力、病程等其他尚不明確的因素有關(guān)，需逐步深入探索。OPBR組內(nèi)，即使是排列疏松的晶粒，其邊緣也大多可見絮狀物附著，高度懷疑其主要成分是蛋白質(zhì)，需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前研究表明，OPBR可表現(xiàn)為膽汁淀粉酶濃度升高和（或）膽道壓力的升高[7]，關(guān)于膽道壓力對(duì)結(jié)石微觀形態(tài)的影響度仍需探索。若通過紅外光譜從成分的角度探索合并OPBR的膽囊結(jié)石特征，能否進(jìn)一步得到啟發(fā)并驗(yàn)證或部分驗(yàn)證本研究的推測(cè)，仍需不斷深入研究。

綜上所述，當(dāng)OPBR發(fā)生時(shí)，晶粒間填充物增多、膽囊結(jié)石與OPBR間相輔相成的惡性循環(huán)，使晶粒彼此聚集更加結(jié)實(shí)、緊密，進(jìn)而使膽囊結(jié)石晶體呈整塊狀或類整塊狀分布。本研究分析結(jié)石微觀結(jié)構(gòu)，探索OPBR成石機(jī)制，可為膽胰匯合部疾病及取石術(shù)后結(jié)石復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)，對(duì)臨床通過EPBS等個(gè)體化治療方式處理結(jié)石原發(fā)病有重要參考價(jià)值。此結(jié)果仍需結(jié)合紅外光譜、X射線能譜、多中心、大樣本及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。

致謝：衷心感謝大連理工大學(xué)化工學(xué)院王同華教授及其團(tuán)隊(duì)對(duì)本研究的技術(shù)支持與指導(dǎo)。