投喂蝦青素對哲羅鮭蝦青素含量和抗氧化力的影響

張立穎，趙 萌，李文通，袁 丁，楊貴強

(北京市水產(chǎn)科學研究所暨國家淡水漁業(yè)工程技術研究中心，北京 100068 )

哲羅鮭(Huchotaimen)，屬鮭形目、鮭科、哲羅鮭屬，是少數(shù)幾種能長到數(shù)百千克的大型淡水經(jīng)濟魚類之一[1-2]。目前，哲羅鮭全人工繁殖和苗種馴化等關鍵問題已經(jīng)解決[3]，其人工養(yǎng)殖規(guī)模正在逐步擴大，哲羅鮭的養(yǎng)殖推廣為廣大養(yǎng)殖戶帶來了良好的經(jīng)濟效益。鮭的肌肉紅色程度被認為是評價其品質(zhì)的重要指標，肌肉的紅色主要來自蝦青素的沉積[4]，由于自身不能合成[5]，因此人工養(yǎng)殖時必須在飼料中添加蝦青素，以改善肌肉顏色，滿足市場需求。蝦青素的結晶或溶液能與蛋白質(zhì)相互作用形成蝦青素—蛋白復合體[6]，從而產(chǎn)生不同的顏色，可大幅度提高鮭的魚肉品質(zhì)。雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)中蝦青素含量為1.5%～3.0%，是目前公認的天然蝦青素最好的生物來源[7-8]。雨生紅球藻中蝦青素的結構以3S，3′S型為主，與鮭科魚類等水產(chǎn)生物體內(nèi)蝦青素結構基本一致[9]，因此其生物吸收效果較好。天然蝦青素獨特的分子結構，使其具有強大的清除氧自由基、抑制單線態(tài)氧的能力[10]，是一種比β-類胡蘿卜素、維生素E更有效的抗氧化劑[11]。

目前關于鮭肌肉著色的研究在國內(nèi)外已有較多報道。張娟娟等[12]發(fā)現(xiàn)，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)飼料中添加100 mg/kg人工合成蝦青素，可使肌肉達到著色要求，蝦青素的沉積率隨時間延長而下降；Albrektsen等[13]發(fā)現(xiàn)，藍鱈(Micromesistiuspoutassou)的魚骨水解物可改善大西洋鮭(Salmosalar)肌肉對人工合成蝦青素的利用率；石焜等[14]認為，雨生紅球藻藻渣可以作為人工蝦青素的有效著色替代品添加到虹鱒飼料中。人工合成蝦青素作為著色劑添加到鮭鱒魚飼料中存在添加成本高、利用率較低的現(xiàn)象，目前亟需研究和開發(fā)利用率較高的天然蝦青素。筆者以哲羅鮭為試驗對象，在飼料中添加人工合成蝦青素和不同含量的雨生紅球藻，研究雨生紅球藻中天然蝦青素對哲羅鮭肌肉蝦青素含量和抗氧化的影響，以期獲得天然蝦青素在哲羅鮭中的最適添加量和作用時間，初步探討蝦青素抗氧化的作用機制，為雨生紅球藻作為飼料添加劑提高哲羅鮭肌肉品質(zhì)研究提供理論和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼料

人工合成蝦青素為購自廣州某公司的飼用蝦青素，對照組蝦青素添加量為100 mg/kg；天然蝦青素為購自荊州市天然蝦青素有限公司的飼料用天然蝦青素粉(雨生紅球藻粉)，蝦青素含量2%～2.3%，試驗各組設計蝦青素添加量分別為10、20、40、60 mg/kg。參照SN/T 2327—2009中檢測方法，測定各處理組中蝦青素實際含量依次為101.68(對照組)、10.27、20.39、41.03和61.32 mg/kg。除蝦青素外其他成分與基礎飼料營養(yǎng)相同；將基礎飼料粉碎，過40目網(wǎng)篩，添加飼用蝦青素粉或雨生紅球藻粉、黏合劑及蒸餾水，重新擠壓制成粒徑4 mm的蝦青素強化沉性顆粒飼料，晾干后2～5 ℃保存，1周內(nèi)投喂，基礎飼料組成見表1。

表1 飼料配方及常規(guī)營養(yǎng)成分

1.2 試驗魚及日常管理

試驗魚由北京市水產(chǎn)科學研究所玉渡山冷水魚基地繁殖培育，平均體質(zhì)量(435.63±21.32) g，試驗分為1個對照組和4個試驗組，每組3個平行，每個平行選取體質(zhì)健壯、外表無傷的受試魚500尾，共7500尾。試驗魚運至北京市水產(chǎn)科學研究所十渡基地后，暫養(yǎng)1個月。試驗開始后分池飼養(yǎng)于15個6 m×2.5 m×1.2 m長方形水泥池中，流水養(yǎng)殖；投喂量約為試驗魚體質(zhì)量的1%，以30 min內(nèi)攝食完為宜，日投喂2次(10:30，16:30)；試驗期間水溫12～18 ℃，溶解氧>6 mg/L，pH 7.0～7.8。養(yǎng)殖周期為70 d。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 蝦青素含量測定

試驗開始后分別在第2周、第4周、第6周、第8周、第10周于每個平行取試驗魚3尾，用0.3‰的苯氧乙醇麻醉后，在魚側線以上的背脊白肌部分取約5.0 g的肌肉2塊，立即凍存于-20 ℃冰箱，待試驗結束后統(tǒng)一送至英格爾檢測技術服務(上海)有限公司測定蝦青素含量，檢測方法參照SN/T 2327—2009《進出口動物源性食品中角黃素、蝦青素的檢測方法》。

1.3.2 抗氧化力指標測定

采用南京建成生物科技研究所試劑盒檢測總抗氧化能力和堿性磷酸酶活性，通過722型可見分光光度計進行比色定量測定。飼養(yǎng)試驗結束后，每個平行抽取試驗魚3尾，用0.3‰的苯氧乙醇麻醉后，尾靜脈抽血，8000 r/min冷凍離心機離心10 min，上層是血清，下層是血細胞，分別取2份血清和血細胞各0.5 mL，4 ℃保存?zhèn)溆茫┛偪寡趸芰y定和堿性磷酸酶測定；分別取2份0.2 g鰓、肝臟、前腸、后腸、幽門垂、肌肉，用0.85%冰生理鹽水沖洗2～3遍，再用吸水紙吸干表面的水分，2份均與0.85%冰生理鹽水按1∶4(體積比)在4 ℃冰水浴條件下用手動玻璃勻漿棒研磨均勻，制成20%的組織勻漿液，冷藏備用，供總抗氧化能力測定和堿性磷酸酶測定。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素重復測量的方差分析和Duncan氏法多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 蝦青素含量

隨著試驗的進行，各處理組肌肉中蝦青素含量先逐步升高，6～8周后蝦青素含量趨于穩(wěn)定(圖1)。各處理組間肌肉蝦青素含量有差異。與對照組相比，20 mg/kg組和40 mg/kg組的蝦青素含量顯著上升(P<0.05)，而且40 mg/kg組的蝦青素含量顯著高于20 mg/kg組(P<0.05)；10 mg/kg組和60 mg/kg組的蝦青素含量差異不顯著(P>0.05)，同時10 mg/kg組和60 mg/kg組間的蝦青素含量差異也不顯著(P>0.05)。

圖1 各處理組哲羅鮭肌肉中蝦青素含量的變化Fig.1 Changes in astaxanthin contents in muscles of taimen H. taimen in each group

2.2 不同組織的總抗氧化能力

投喂雨生紅球藻對哲羅鮭各組織的總抗氧化能力影響見圖2。試驗組哲羅鮭各組織(肌肉組除外)的總抗氧化能力顯著高于對照組(P<0.05)；并且隨著雨生紅球藻添加量的增加，各組織的總抗氧化能力呈現(xiàn)先升后降的趨勢。其他組織的各處理組間天然蝦青素增強總抗氧化能力效果有差異。與對照組相比，4個試驗組哲羅鮭鰓、肝臟、前腸、后腸、幽門垂、血清、血細胞的總抗氧化能力均顯著高于對照組(P<0.05)，40 mg/kg組肌肉、鰓、肝臟、后腸、幽門垂、血清的總抗氧化能力最高，顯著高于其他試驗組(P<0.05)，40 mg/kg組哲羅鮭血細胞的總抗氧化能力顯著高于10 mg/kg組和60 mg/kg組(P<0.05)。

2.3 不同組織的堿性磷酸酶活性

投喂雨生紅球藻對哲羅鮭各組織堿性磷酸酶活性的影響見圖3。試驗組哲羅鮭各組織的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組(P<0.05)；并且隨著雨生紅球藻添加量的增加，各組織的堿性磷酸酶活性大部分呈現(xiàn)先升后降的趨勢。8種組織各處理組間天然蝦青素增強總抗氧化能力效果存在差異。4個試驗組哲羅鮭鰓、后腸、幽門垂、肌肉、血清、血細胞的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，20 mg/kg組和40 mg/kg組哲羅鮭肝臟、前腸的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組(P<0.05)；40 mg/kg組哲羅鮭前腸、幽門垂、肌肉、血清、血細胞的堿性磷酸酶活性顯著高于其他試驗組(P<0.05)，40 mg/kg組哲羅鮭鰓的堿性磷酸酶活性顯著高于20 mg/kg組和60 mg/kg組(P<0.05)，40 mg/kg組哲羅鮭肝的堿性磷酸酶活性顯著高于10 mg/kg組和20 mg/kg組(P<0.05)，40 mg/kg組哲羅鮭后腸的堿性磷酸酶活性顯著高于10 mg/kg組和60 mg/kg組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 肌肉中蝦青素含量

鮭鱒魚類的肌肉紅色程度是評價其品質(zhì)的重要指標，但其自身不能合成蝦青素[11]，因此，常在養(yǎng)殖過程中添加蝦青素，通過蝦青素與魚肌肉中蛋白質(zhì)相互作用形成蝦青素—蛋白復合體來改善其肌肉色澤。本試驗中，在飼料中添加100 mg/kg人工合成蝦青素，試驗魚肌肉中蝦青素含量3.9～4.7 mg/kg；在飼料中添加20～40 mg/kg天然蝦青素(雨生紅球藻源)，試驗魚肌肉中蝦青素含量4.1～5.1 mg/kg(圖1)，相較于對照組顯著較高(P<0.05)，這與雨生紅球藻藻渣用于著色虹鱒的研究結果[14]一致，推測這可能是雨生紅球藻蝦青素可與肌紅蛋白非特異結合[15]，具有極強的色素沉積能力；同時雨生紅球藻中的蝦青素以左旋結構3 S，3′S構型為主，與動物體內(nèi)的蝦青素旋光結構基本一致，可能有助于機體對蝦青素的快速吸收和較高的利用率[16-17]；而人工蝦青素旋光結構具有多種形式，其中n(左旋)∶n(消旋)∶n(右旋)=1∶2∶1[18]，這造成人工合成蝦青素在功能上與天然蝦青素有很大差異[19]，且在動物體內(nèi)無法轉化為天然構型[16]，所以人工合成蝦青素的生物吸收效果不理想。本試驗結果顯著低于虹鱒的蝦青素含量6.1～8.6 mg/kg[20-21]，這可能與鮭鱒的物種特性有關。在飼料中添加60 mg/kg天然蝦青素(雨生紅球藻源)，試驗魚肌肉中蝦青素含量4.1～4.5 mg/kg與對照組相比，差異不顯著(P>0.05)，這與Page等[22]的研究結果相同，其原因是魚體攝入過多蝦青素可能導致蝦青素降解。因此，建議哲羅鮭飼料中天然蝦青素(雨生紅球藻源)的添加量為20～40 mg/kg。

3.2 抗氧化能力和免疫指標

近年來，關于蝦青素的研究，逐漸轉移到對機體抗氧化和免疫功能的影響上[20,25-27]。人工合成蝦青素是一種重要的紅色含氧類胡蘿卜素，主要通過猝滅脂溶性自由基實現(xiàn)其抗氧化功能，其抗氧化活力是β-胡蘿卜素的10倍、維生素E的100倍[6,23]。

圖2 投喂雨生紅球藻后哲羅鮭各組織的總抗氧化能力變化情況Fig.2 Changes in total antioxidant capacities of tissues in taimen H. taimen fed the diets containing green alga H. pluvialis

圖3 投喂雨生紅球藻后哲羅鮭各組織的堿性磷酸酶活性變化情況Fig.3 Changes in alkaline phosphatase activities of tissues in taimen H. taimen fed the diets containing green alga H. pluvialis

總抗氧化能力是用于衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標[24]，Zhang等[20,25]指出，在虹鱒飼料中添加100 mg/kg蝦青素，可顯著增強虹鱒肝臟總抗氧化能力。本試驗中，4個試驗組哲羅鮭鰓、肝臟、前腸、后腸、幽門垂、血清、血細胞的總抗氧化能力顯著高于對照組(P<0.05)(圖2)，上述結果表明，雨生紅球藻中的天然蝦青素比人工蝦青素能更有效地提高哲羅鮭機體綜合抗氧化能力，這與其具有共軛雙鍵鏈及不飽和酮基和羥基的特殊分子結構有關，該結構能提供吸引自由基的未配對電子，從而有效地猝滅附近的自由基及有害的活性氧，起到顯著的抗氧化功效[20-21,25]。

堿性磷酸酶是動物代謝過程中重要的調(diào)控酶，可催化所有磷酸單酯及磷酸基團的轉移反應，直接參與磷的代謝，同時對水中鈣質(zhì)的吸收、磷酸鈣的形成、甲殼素的分泌及形成均具有重要作用，是水產(chǎn)動物賴以生長、生存的重要酶類之一[26]。血清堿性磷酸酶存在于腸黏膜、骨骼、肝臟、腎臟、肺及血細胞中[27]。本試驗中隨著試驗魚血清中堿性磷酸酶活性升高，肝臟組織未發(fā)生病變,4個試驗組哲羅鮭鰓、后腸、幽門垂、肌肉、血清、血細胞的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組(P<0.05)(圖3)，說明添加天然蝦青素可促進哲羅鮭細胞中的物質(zhì)代謝，促進其生長，間接增強其非特異性免疫能力。40 mg/kg組堿性磷酸酶活力最高，表明該添加量的雨生紅球藻使魚體處于最佳的鈣磷代謝狀態(tài)，該結果與蝦青素對錦鯉(Cyprinuscarpio)的影響作用[28]相一致。蝦青素屬于葉黃素類胡蘿卜素，張茂華等[29]研究發(fā)現(xiàn)，鈣和葉黃素在肉雞腸道內(nèi)吸收也存在競爭，高鈣會抑制葉黃素吸收。在動物營養(yǎng)研究中，血清堿性磷酸酶活性常作為重要的生化檢測指標協(xié)助評定日糧鈣、磷水平的適宜程度[30]。劉俠等[31]研究發(fā)現(xiàn)，鈣化在酶失活、缺乏Ca2+或PO43-的條件下不會發(fā)生，堿性磷酸酶對鈣化的發(fā)生是必需的，堿性磷酸酶活性越高，鈣化速度越快；同時，鈣化會加速堿性磷酸酶失活，鈣化速度越快，堿性磷酸酶活性降低越快。本試驗中，60 mg/kg組過高的蝦青素含量有可能在一定程度上使堿性磷酸酶失活，鈣化速度減慢，造成堿性磷酸酶活性降低。因此，對不同的水產(chǎn)動物要給予不同的條件，保持其最高活力，以有利于動物的生長。

4 結 論

與添加100 mg/kg人工合成蝦青素相比，飼料中添加20～40 mg/kg天然蝦青素能顯著提高哲羅肌肉蝦青素含量、總抗氧化能力以及堿性磷酸酶活性，在哲羅鮭飼料中的建議天然蝦青素添加量為40 mg/kg。