血清γ-干擾素誘導蛋白10對活動性肺結核的診斷價值

張雪 沙玉霞 周浩泉 潘家華 朱孝武 郇霞 王華

2017年全球新發結核病患者約1000萬，小于15歲兒童占到10%，發病高峰年齡為0～4歲和16～24歲[1]。雖然目前我國已普及卡介苗的接種，仍未阻止兒童青少年結核病的發生，其臨床特征極不典型，常被誤診誤治，且無有效快速檢測診斷手段。有研究[2-3]指出成人活動性肺結核或結核性胸膜炎、結核性腦膜炎患者血漿和胸腔積液、腦脊液中γ-干擾素誘導蛋白10(Interferon induced protein 10,IP-10)水平升高明顯，并提出利用IP-10的檢測可作為結核病的早期診斷依據，但是關于IP-10對兒童青少年結核感染診斷價值相關報道甚少。本文通過對兒童青少年肺結核和非結核感染者進行IP-10檢測和結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT)，以探討IP-10在兒童青少年活動性肺結核的臨床診斷意義。

資料與方法

一、研究對象

(1)活動性肺結核組：2018年3月-2019年2月就診于山南市人民醫院感染科和安徽省立醫院感染科、安徽省胸科醫院結核科確診肺結核兒童青少年92人。納入標準：①所有肺結核病例的診斷在流行病學、臨床癥狀、體征、胸部影像學表現、實驗室檢查等方面均嚴格遵守《肺結核診斷標準WS 288-2017》診斷標準[4]，②獲得患兒或其監護人書面知情，③入組對象依從性良好；(2)對照組：同期于山南市人民醫院和安徽省立醫院體檢的無活動性結核病兒童青少年107人。納入標準：①結核病癥狀篩查陰性，PPD試驗及胸片均陰性，并結合其他輔助檢測方法隨訪跟蹤一年后未提示結核感染，②獲得患兒或其監護人書面知情，③入組對象依從性良好。排除標準：患肺外結核病者，患有乙型肝炎、艾滋病、免疫缺陷病或其他疾病需激素治療者，參與其他臨床研究者。

本研究經安徽省立醫院、安徽省胸科醫院、西藏山南市人民醫院倫理委員會審核通過，所有入組者均簽署知情同意書。入組年齡7～18歲，男105例(52.8%)，女94例(47.2%)，平均年齡(13.6±2.2)歲；兩組在種族、性別、年齡之間，經比較均無統計學差異。

二、方法

1 血標本采集：所有研究對象均采集外周靜脈血2 mL，4℃放置過夜后，4℃5000 rpm，離心10 min，分離血清，裝于EP管，于-20℃貯存，進行后續檢測IP-10；同時合肥地區肺結核組43例和對照組50例亦采取肝素抗凝外周新鮮血4 mL，以進行結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT)檢測。

2 試劑來源：CXCL10 ELISA試劑盒購于Abnova公司(貨號KA：2004)。T-SPOT.TB試劑盒來自上海復星高科技集團，淋巴細胞分離液來自北京索萊寶科技有限公司。

3 操作步驟：IP-10檢測方法：采用酶聯免疫方法，取ELISA試劑盒中的96孔板，分別設定好標準孔和樣本孔，標準孔中加入預先準備好的標準品100 μL，樣品孔分別加入100 μL樣品，空白對照孔加入100 μL的樣品稀釋液，37℃孵育90 min，吸凈液體，每孔中加入生物素化的IP-10抗體，37℃孵育60 min，洗滌緩沖液洗3次，每孔中加入100 μL的親和素-生物素-過氧化物酶復合物，37℃孵育30 min，洗滌緩沖液洗五次，每孔加入90 μL的顯色劑，室溫避光孵育30 min，每孔加入100 μL的終止液，30 min內使用酶標儀在492nm處檢測吸光度，進行結果分析。

血T-SPOT檢測方法：采用體外釋放酶聯免疫法，由研究人員在4 h內完成肝素抗凝外周新鮮血4 mL進行T-SPOT.TB檢測。首先按照試劑盒說明書快速分離淋巴細胞，配制每100 μL含有25萬個細胞的標準溶液500 μL進行外周血單個核細胞的收集與計數，參照試劑盒使用說明書檢測步驟操作，記錄每個反應孔內深藍色清晰的斑點，分析結果。目視法判定標準:陽性對照孔內斑點數≥20個視為實驗有效；陰性對照孔內斑點數為≤5個，任一實驗孔內斑點數-陰性孔斑點數≥6個，認定結果為陽性；若陰性對照孔內斑點數≥6個，任一實驗孔內斑點數≥陰性孔斑內點數×2，認定結果為陽性；若任一實驗孔內斑點數<20個，且陽性對照孔內斑點數≥20個，認定結果為陰性。

三、統計學方法

結 果

一、活動性肺結核組和對照組比較

活動性肺結核組IP-10濃度(295.55±21.69 pg/mL)明顯高于對照組(44.46±4.32 pg/mL)，差異具有顯著性統計學意義(P<0.01)(見表1)。

二、IP-10在活動性肺結核診斷臨界值及ROC曲線

從ROC曲線得出，曲線下面積(AUC)0.921，IP-10的ROC曲線下面積95%可信區間為(0.882～0.960)。IP-10診斷活動性肺結核的臨界濃度值為155.82 pg/mL，取臨界值時，其診斷活動性肺結核的敏感性為75.5%，特異性為95.9%，Yonden指數(特異性+敏感性-1)為0.714，表明IP-10可作為活動性肺結核的診斷指標(見圖1)。

表1 肺結核組和對照組IP-10測定結果

圖1 IP-10的ROC曲線

三、血IP-10和血T-SPOT檢測對活動性肺結核的敏感性、特異性結果比較

結合圖1，取血IP-10臨界診斷值時敏感性(75.5%)、特異性(95.9%) ，其在92例肺結核組和107例非結核感染對照組真陽性者69例，真陰性者103例。與血T-SPOT檢測結果比較顯示血IP-10敏感性(75.5%)低于血T-SPOT(90.7%)，經統計學比較χ2值=4.513，P=0.034；其特異性(95.9%) 明顯高于血T-SPOT(84%) ，經統計學比較χ2值=7.258，P=0.019(見表2)。

表2 活動性肺結核血IP-10和血T-SPOT的敏感性、特異性比較

討 論

兒童青少年是社會發展和進步的重要階梯部分，其感染結核分枝桿菌后起病隱襲、進展慢，臨床醫生對該年齡段結核病的認識不足，檢查檢驗方法的靈敏度和特異性低，難以獲得結核分枝桿菌的陽性結果，臨床診斷較困難。兒童青少年肺結核的延遲診斷可能造成學校和幼兒園等環境出現結核病傳播的危害，造成學校聚集性爆發。多數兒童和青少年感染結核桿菌后未得到及時診治，引起粟粒性肺結核、肺外結核病等嚴重感染，不同程度的影響其生長發育、學業和未來工作，是引起成年后結核病的主要因素，也是評估一個國家未來結核病控制情況，因此對于兒童青少年結核病需要早期發現、及時規律治療。

IP-10是由IFN-γ誘導產生的一種趨化因子，參與遲發性超敏反應，趨化活化T細胞至炎癥感染部位，擴大Th1反應，增加γ干擾素基因表達等參與疾病發生發展，趨化CXCR3+細胞到炎癥部位發揮抗炎或促炎作用、誘導細胞凋亡及增殖、抑制新生血管形成、抗病毒等，其靶向治療已應用到臨床。有研究[5]指出結核分枝桿菌感染者可分泌大量IP-10以趨化各種炎癥細胞和炎癥因子，提出其可作為結核感染及活動性結核病診治和評估療效的生物學指標。2014年Latorre等[6]指出IFN-γ結合IP-10檢測有助于診斷兒童活動性肺結核和潛伏性結核感染，IP-10是診斷兒童結核病的一個精確生物標志物。

本研究顯示在兒童青少年肺結核患者中IP-10濃度(295.55±21.69 pg/mL)明顯高于對照組(44.46±4.32 pg/mL)，差異具有統計學意義，與張迪等[7]對成人結核病的研究結果一致，但與一項<5歲兒童結核感染的研究[8]結果不同，提示兒童青少年活動性肺結核IP-10水平與成人相仿，可能與兒童青少年機體細胞與體液免疫功能已達成人水平有關，IP-10水平可能存在一定的年齡依賴性。本研究IP-10曲線下面積(AUC)大于0.9，IP-10的ROC曲線下面積95%可信區間為(0.882～0.960)，其診斷活動性肺結核的臨界濃度值為155.82 pg/mL，敏感性為75.5%，特異性為95.9%，Yonden指數(特異性+敏感性-1)為0.714，表明IP-10可作為兒童青少年活動性肺結核的輔助診斷指標，與Mamishi Setareh等[9]觀點一致。

T- SPOT.TB檢測原理是通過分離外周血MTB特異性T細胞，經體外培養和抗原再次刺激后分泌IFN-γ,以相應抗體檢驗IFN-γ濃度來診斷是否存在MTB感染，但是易受到外周血T淋巴細胞數量的影響[10]，多數研究均指出T-SPOT敏感性和特異性明顯高于TST，但是其敏感性和特異性仍有爭議[11]。2008-2017年湖南省兒童醫院結核病住院患兒多為3～12歲兒童，肺結核T-SPOT.TB檢測結果陽性率(82.26%)高于肺外結核(52.86%)[12]。有研究[13]提出血IP-10與IFN-γ聯合檢測能夠提高潛伏性結核感染的臨床診斷，并可用于其臨床療效的評估。本研究結果顯示血IP-10敏感性(75.5%)低于血T-SPOT(90.7%)，但其特異性(95.9%)明顯高于血T-SPOT(84%)，提示血IP-10可作為臨床診斷活動性肺結核輔助檢測指標，與T-spot聯合有助于提高臨床診斷及鑒別診斷，以減少臨床漏診和誤診。

綜上所述，本研究肺結核組IP-10濃度明顯高于對照組，提示IP-10可作為兒童青少年活動性肺結核的輔助診斷指標，ROC曲線提示IP-10診斷活動性肺結核的特異性高于T-SPOT，與T-SPOT聯合應用能夠快速準確診斷兒童青少年活動性肺結核，關于IP-10臨床應用以及聯合T-SPOT對兒童青少年結核病的臨床價值可通過進一步擴大樣本量進行探討。