miR-539通過靶向調控DCLK1抑制非小細胞肺癌的侵襲能力

陳衛萍 朱嵩 田東波

肺癌是全球癌癥死亡的第一大原因[1]。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有原發性肺癌病例的80%[2]，大多數NSCLC患者被診斷為晚期，預后較差[3]。 高復發率、易遠處轉移是肺癌高死亡率的主要原因。因此，闡明NSCLC侵襲、轉移的分子機制，對NSCLC患者的臨床治療有重要意義。microRNA(miRNA)是一類單鏈、小型非編碼RNA(長度為19-25個核苷酸)，通過與靶基因的3′端非編碼區(3′-UTR)互補結合，調節其靶基因表達[4]。據報道，miR-539在多種癌細胞中均下調，表明其在癌癥進展中起到關鍵的作用。然而，在肺癌范圍內關于miR-539調節肺癌細胞侵襲、遷移的研究尚未有報道。本研究希望通過調節miR-539在肺癌細胞中的表達，探究miR-539對肺癌細胞侵襲能力的影響，期望能對NSCLC的治療策略提供新的靶點。

資料與方法

一、材料

1. 細胞株：人非小細胞肺癌細胞株A549細胞和NCI-H1299細胞由清遠市人民醫院實驗中心保存。miR-539購自公司。DCLK1過表達載體由清遠市人民醫院實驗中心保存。

2. 主要試劑：高糖DMEM培養基、RPMI1640培養基及10%胎牛血清均購自Gibco公司。Trizol購自天根公司。逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑購自Takra公司。定點突變試劑盒購自南京諾唯贊公司。Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒購自Promega公司。

3. 細胞培養：非小細胞肺癌細胞株A549細胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液; NCI-H1299采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液。所有細胞系在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

4. 病例來源：從GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫下載基因微陣列表達數據GSE16025(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE16025)，該數據集使用GPL5106平臺，包含71個樣本，其中61例非小細胞肺癌組織樣本，10例正常肺組織樣本。

二、方法

1. 轉染實驗：實驗中所用的miR-539 mimic(miR-539)、miRNA陰性對照(miR-NC)、miR-539抑制劑(anti-miR-539)、抑制劑陰性對照(anti-miR-NC)由GenePharma公司(中國上海)合成。 轉染步驟如下，將細胞接種到6孔板中，并根據制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進行轉染測定。轉染48 h后，收獲細胞用于進一步分析研究。

2. RNA提取與熒光實時定量PCR：用TRIzol試劑(Tiagen公司，中國)從培養的細胞和組織樣品中提取總RNA。以總RNA為模板，使用Reverse Transcription 試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)獲得RNA的反轉錄產物，使用Taqman MicroRNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems，CA，USA)獲得miRNA的反轉錄產物。通過miScript SYBR Green PCR 試劑盒(Qiagen，Germany)和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa，Japan)在ABI7500 熒光定量PCR上測量miRNA或mRNA的表達水平。U6和GAPDH分別用作內參。數據使用2-△△Ct法計算miRNA或mRNA的相對表達量。實驗中所用到的引物(見表1)。

表1 本研究所用到的引物

3. 構建報告基因載體：合成預測為miR-539結合位點的DCLK1的3′UTR區的野生型序列，及相應的3′-UTR結合點突變型序列，并將其結合到psi-CHECK2載體(Promega, WI, USA)中，獲得野生型psi-DCLK1-3′UTR(DCLK1-3′UTR)及突變型psi-DCLK1-3′UTR(DCLK1-3′UTR-mut)重組質粒。

4. 雙熒光素酶報告基因實驗：雙熒光素酶報告實驗步驟如下，將HEK-293T細胞接種到6孔板中，并根據制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共轉染野生型DCLK1-3′UTR質粒、突變型DCLK1-3′UTR-mut質粒以及miR-539或miR-NC。溫育48 h后，使用Dual Luciferase Reporter試劑盒(Promega)評估熒光素酶活性。

5. 細胞侵襲實驗：將總共5×104個肺癌A549細胞懸浮在200μl無血清培養基中，并接種于Transwell小室的上層。 將含有10%FBS的完全培養基添加到小室下層。 在37 ℃、5%CO2中孵育24 h后，將小室放入甲醇中固定15 min，吸去小室上層培養基并用棉簽小心擦拭干凈，去除尚未從上室遷移出的細胞。隨后將小室放入1%的結晶紫染色15 min，然后在顯微鏡下計數。

三、統計學分析

結 果

一、miR-539在非小細胞肺癌中低表達且與患者較差的預后負相關

通過數據庫dbDEMC(version2.0，http://www.picb.ac.cn/dbDEMC/search.php)統計后證實miR-539在61例非小細胞肺癌組織中的表達量(5.49±0.15)顯著低于其在10例正常肺組織中的表達量(5.72±0.25)(t=3.79，P=3.10×10-4，見圖1)。同時在235例高表達miR-539的非小細胞肺癌患者和102例低表達miR-539的非小細胞肺癌患者中進行預后分析，結果顯示miR-539高表達的非小細胞肺癌患者預后較好，而miR-539低表達的患者預后較差[HR=0.67(0.47～0.97)，P=0.033(見圖2)]。這表明miR-539在非小細胞肺癌中可能起到抑癌基因的作用。

圖1 非小細胞肺癌組織和正常肺組織中miR-539的相對表達量

二、miR-539抑制非小細胞肺癌細胞侵襲能力

在A549細胞中分別過表達miR-539、轉染miR-539抑制劑，并用熒光定量PCR技術檢測過表達及沉默效果(圖3，4)。Transwell侵襲實驗結果顯示，在A549細胞中過表達miR-539，A549細胞的侵襲能力相比對照組明顯降低(t=49.40，P=3.12×10-11，圖5A)。相反的，在A549細胞中沉默miR-539，A549細胞的侵襲能力較對照組顯著的增強(t=-58.65，P=7.93×10-12)(圖5B)。這表明，miR-539能抑制肺癌細胞A549的侵襲能力。

圖2 miR-539對非小細胞肺癌患者預后的影響

圖3 用miR-539 mimics轉染A549細胞后miR-539的表達變化

圖4 用anti-miR-539轉染A549細胞后miR-539的表達變化

圖5 miR-539對肺癌細胞侵襲能力的影響(×100)

三、miR-539靶向調控DCLK1

為了尋找miR-539抑制肺癌A549細胞侵襲能力的原因，首先通過在線軟件microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)預測miR-539的潛在靶基因。我們發現DCLK1的3′UTR區存在miR-539的結合位點(見圖6)。其次在A539細胞中過表達miR-539，用熒光定量PCR的方法檢測。結果發現，miR-539可顯著降低DCLK1的表達(F=115.87，P=7.93×10-4)(見圖7)。為了證明DCLK1的表達水平降低是由miR-539直接結合所導致，我們構建了野生型DCLK1-3′UTR載體，以及與miR-539結合位點突變的DCLK1-3′UTR-mut載體，并開展了雙熒光素酶報告實驗。在HEK-293T細胞中過表達miR-539可明顯下調野生型DCLK1-3′UTR的熒光素酶活性(P=1.03×10-6)(圖8)，但是對突變型DCLK1-3′UTR-mut的熒光素酶活性沒有影響(P>0.05)(圖8)。這表明miR-539可以直接靶向抑制DCLK1的表達。

圖6 生物信息學預測DCLK1的3′UTR區存在miR-539的結合位點

圖7 過表達miR-539對肺癌A549細胞DCLK1表達量的影響

圖8 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-539對DCLK1相對熒光素酶活性的影響 注：***P<0.0001

討 論

已有的研究表明，miRNA在轉錄、轉錄后水平上充當基因表達的關鍵調節劑，與人類腫瘤的發生密切相關[5]。表達失調的miRNA充當腫瘤抑制因子或致癌基因，以調節大多數人類癌癥的發生和發展[6-8]。越來越多的證據表明，某些miRNA可用作肺癌的預后生物標志物和潛在治療靶標[9-10]。

先前的報道表明，miR-539在多種惡性腫瘤中均表現為抑癌作用，包括神經膠質瘤[11]、肝細胞癌[12]、結直腸癌[13]、鼻咽癌[14]和乳腺癌[15]。Jin H也報道說，miR-539能夠通過靶向基質金屬蛋白酶8抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移[16]。本研究首先分析數據庫資料，發現miR-539在非小細胞肺癌中的表達量顯著低于其在癌旁組織中的表達量。在細胞水平研究發現，miR-539在肺癌細胞中的表達量顯著低于正常肺上皮細胞。Transwell侵襲實驗結果表明，miR-539抑制肺癌細胞A549的侵襲能力。這些結果表明，miR-539在肺癌發生發展中可能發揮抑癌作用。

miRNA對腫瘤細胞功能的調控，一般來自對靶基因的調節[17]。為進一步研究miR-539抑制肺癌細胞A549侵襲能力的機制，我們利用 microRNA.org預測miR-539的潛在靶基因，觀察到DCLK1是miR-539的潛在靶基因。DCLK1又稱雙腎上腺皮質激素樣激酶-1，它是蛋白激酶超家族和雙皮質素家族的重要成員[18]。已有研究表明DCLK1參與了腫瘤上皮-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程[19]。EMT常常伴隨著細胞形態和行為的顯著變化，影響細胞增殖、分化、粘附和遷移能力； 此外，EMT 可以增強癌細胞的遷移和侵襲特性，并與誘導腫瘤干細胞特性相關[20-21]。Ikezono報道，胰腺癌細胞中，DCLK1通過上調EMT相關基因Slug、N-Cadherin，促進胰腺癌細胞的遷移、侵襲能力[22]。本研究通過熒光素酶報告實驗進行了驗證，發現與突變型DCLK1-3′UTR-mut報告基因相比，miR-539顯著降低了野生型DCLK1-3′UTR-WT報告基因的熒光素酶活性。說明miR-539可能是通過下調DCLK1發揮抑癌功能的。基于以上研究結果，推測miR-539對肺癌細胞侵襲能力的抑制作用，可能是通過靶向抑制DCLK1的表達，從而間接調節EMT而實現的。

綜上所述，我們首先發現miR-539在非小細胞肺癌中低表達，進而發現過表達miR-539能抑制肺癌細胞的侵襲能力，其作用機制可能是通過靶向沉默DCLK1，間接調節EMT而抑制肺癌細胞的侵襲能力。miR-539可能是肺癌發展中的抑癌基因，能否為肺癌的治療策略提供了新的靶點，還有待進一步探討。