分化抗原簇63在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

趙軍喜 康征 李鵬 宋小雪 杜錦龍 李強如

肺癌是最常見的呼吸道惡性腫瘤，分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的85%[1]。大多數NSCLC患者確診時已處于晚期階段或有局部轉移，盡管治療NSCLC的臨床試驗有所進展，但患者的5年存活率僅有15%[2]。尋找準確預測患者預后的生物標記物，提高患者的生存率具有重要的臨床價值。CD63為四跨膜蛋白家族中的一員，為一種腫瘤抑制因子，參與許多生物學過程，包括細胞生長、粘附、遷移和分化，CD63敲低后通過調節基質金屬蛋白酶的表達促進腫瘤細胞發生侵襲[3-4]。目前已有研究顯示，CD63在舌鱗狀細胞癌、食管癌和腎癌中表達水平降低[3，5-6]。CD63在NSCLC中的研究較少，本文通過檢測NSCLC組織中CD63的表達水平，進一步分析CD63的表達對患者的臨床特征和預后的影響。

資料與方法

一、一般資料

收集2013年6月-2015年1月在安陽市第二人民醫院接受根治手術的NSCLC患者126例，男性102例，女性24例，年齡35～72歲，術后行輔助化療，以順鉑為基礎的聯合化療，例如長春瑞濱+順鉑、紫杉醇+順鉑、依托泊苷+順鉑。收集患者的腫瘤組織標本，制作成石蠟切片保存。收集患者的一般臨床資料包括：年齡、性別、吸煙史、腫瘤類型、腫瘤分期、淋巴結轉移、TNM分期和手術方式。治療結束后第1年之內每3個月復查1次，第2年和第3年每6個月復查1次，第4年之后每年復查1次。隨訪時間5-60個月，中位隨訪時間38個月，失訪4例，失訪率為3.2%。本研究經醫院倫理委員會批準，患者同意并簽署知情同意書。

二、方法

免疫組化檢測：石蠟切片置于60 ℃烘箱中30 min，室溫放涼后置于二甲苯中脫蠟，然后將玻片依次置于梯度酒精中水化，最后用PBS沖洗。取一定量EDTA緩沖液加入耐高溫微波盒中，將組織切片置于配套的塑料玻片架上，放入緩沖液中加熱。室溫自然冷卻，從緩沖液中取出玻片用PBS沖洗。吸水紙將組織周圍多余水分吸干，每張玻片加100 μl 5% BSA室溫封閉30 min。直接吸去切片上多余的BSA液體，每張切片加20ul稀釋的CD63一抗(1 ∶1 000)，置于濕盒中，4℃冰箱孵育過夜。從冰箱中取出濕盒，室溫復溫10 min，用PBS沖洗3次，每次5 min。吸去組織周圍多余水分，每張切片加50 ul相應種屬二抗(1 ∶4 000)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次，每次5 min。每張切片加100 ul新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下觀察組織顏色變化，出現棕褐色時立即將切片置于自來水中終止顯色。蘇木素滴加于切片組織上，30 s后置于自來水中終止顯色。1%鹽酸酒精中分化3-5 s，自來水沖洗10 min返藍(避免直接沖刷組織)，切片經梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，通風櫥中晾干，顯微鏡下觀察。H-score分數= 3×強烈百分比染色的細胞+2×中度染色的百分比細胞+弱染色細胞的百分比。將H-score分數≤100定義為CD63低表達，H-score分數>100定義為CD63高表達。

三、統計學方法

采用SPSS 21.0軟件處理數據，計數資料以%形式表示，采用卡方檢驗，Kaplan-Meier分析方法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較患者生存率，單因素及多因素Cox回歸模型分析影響患者預后的獨立危險因素，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 CD63在NSCLC組織中的表達情況

CD63在鱗狀細胞癌中43例高表達，35例低表達，腺癌中22例高表達，18例低表達，在其它類型組織中5例高表達，3例低表達，CD63的高表達率為55.6%(70/126)，低表達率為44.4%(56/126)。

二、CD63的表達水平對患者臨床特征的影響

CD63高表達組與低表達組之間患者的年齡、性別、吸煙史和組織類型之間差異無統計學意義(P>0.05)，腫瘤分期、淋巴轉移和TNM分期組間差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 CD63的表達水平對患者臨床特征的影響

三、CD63的表達水平對患者5年生存率的影響

CD63低表達組中位生存時間為48.5個月，5年PFS為23.2%(13/56)，CD63高表達組，中位生存時間為58.4個月，PFS為47.1%(33/70)。CD63低表達組5年總存活率、中位生存時間和PFS均低于CD63高表達組。

圖1 CD63在NSCLC組織中的表達情況(×200)

四、單因素和多因素Cox風險回歸模型分析影響患者預后的獨立危險因素

單因素Cox風險回歸分析結果顯示，NSCLC患者DFS和OS與患者年齡、性別、吸煙、組織類型無關，而與患者的腫瘤分期、淋巴結轉移、TNM分期和CD63的表達水平有關。將上述預后相關因素代入多因素Cox風險回歸模型分析結果顯示，NSCLC患者DFS和OS與患者腫瘤分期、淋巴結轉移、TNM分期和CD63的表達水平有關。腫瘤分期、淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期和CD63低表達均為NSCLC患者預后不良的獨立危險因素。

圖2 CD63的表達水平對患者5年生存率的影響

表2 單因素和多因素Cox風險回歸模型分析影響患者DFS的獨立危險因素

表3 單因素和多因素Cox風險回歸模型分析影響患者OS的獨立危險因素

討 論

CD63是跨膜4種超家族蛋白(TM4SFP)被稱為四跨膜蛋白中的具有抑制腫瘤轉移作用的基因成員，是一種溶酶體膜黏附蛋白[7]。有研究顯示CD63在體內對細胞的生長、轉移和運動具有一定影響，但在體外對細胞則無此作用，提示CD63在體內可能與某種配體相結合發揮作用[8-9]。CD63在腫瘤中研究較為廣泛，Kaprio等[10]研究顯示，CD63的表達與結直腸癌患者腫瘤分期、分化程度和粘液組織學類型有關，CD63表達缺失后可誘導間質-上皮轉化，為結直腸癌不良預后的獨立危險因素。CD63在胰腺腫瘤原發灶中的表達水平顯著高于轉移部位，且CD63低表達患者的PFS和OS顯著降低[11]。夏志軍等[12]研究顯示，CD63在卵巢癌中的表達水平降低，在晚期卵巢癌、早期卵巢癌和良性卵巢病變中的表達水平不同，與卵巢癌患者的不良預后相關。

在本研究中共收集126例NSCLC患者，在NSCLC組織中CD63的高表達率為55.6%，低表達率為44.4%，且在較高的腫瘤分期和TNM分期中，CD63低表達組患者所占的比例較高。CD63的表達水平降低后，對腫瘤轉移的抑制作用減弱，進而促進腫瘤的進展。在淋巴轉移陽性的患者中CD63低表達組患者所占比例顯著高于CD63高表達組，說明CD63的水平降低可促進淋巴結轉移。有研究顯示CD63的表達降低可導致腫瘤進展，并降低患者生存率[13-14]。在本研究中，CD63低表達組患者的5年中位生存時間和PFS均顯著低于CD63高表達組，經過單因素和多因素Cox風險模型回歸分析結果顯示，CD63低表達為患者預后不良的獨立危險因素。綜上所述，CD63低表達促進腫瘤進展和淋巴結轉移為患者預后不良的獨立危險因素，有可能成為評估NSCLC預后的重要因子。