銅綠假單胞菌注射液對(duì)肺癌A549細(xì)胞自噬及PI3K/Akt通路的影響

趙智 董仁松

隨著社會(huì)的發(fā)展，環(huán)境和生活方式的不斷改變，肺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害人們的生命健康[1-2]。自噬是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，目前大量研究顯示，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和臨床診治中起著重要作用[3-5]，通過(guò)影響鼻咽癌細(xì)胞自噬行為可以增強(qiáng)其對(duì)放療的敏感性[6]。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K) /蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性，抑制肺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡[7]，通過(guò)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的研究，可以有效找到肺癌臨床預(yù)防和治療的新藥物。銅綠假單胞菌注射液(pseudomonas aeruginosa，PA-MSHA)可用于癌癥的臨床治療，研究顯示PA-MSHA可以抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[8]，然而關(guān)于PA-MSHA對(duì)肺癌細(xì)胞自噬的影響及其作用機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)觀察PA-MSHA對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、自噬的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為肺癌的臨床診治提供一定理論基礎(chǔ)。

資料與方法

一、主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：31600034)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LY294002(貨號(hào)：PHZ1144)購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾公司；PA-MSHA(國(guó)藥準(zhǔn)字S20043022)購(gòu)自北京萬(wàn)特爾生物制藥有限公司；MTT試劑盒(貨號(hào)：GM01-500T)購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司；PI3K抗體(貨號(hào)：ab32089)、AKT抗體(貨號(hào)：ab38449)、p-AKT抗體(貨號(hào)：ab8805)、p62抗體(貨號(hào)：91526)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體(貨號(hào)：ab51520)購(gòu)自abcam公司；p-PI3K抗體(貨號(hào)：kl-6417R)購(gòu)自中國(guó)康朗生物公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(貨號(hào)：BHR101)購(gòu)自北京博爾西科技有限公司；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(型號(hào)：AU5800)購(gòu)自北京市六一儀器廠；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購(gòu)自日本松下公司；酶聯(lián)免疫分析儀(型號(hào)：EVO75)購(gòu)自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號(hào)：MDF-U32V)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；通過(guò)透射電子顯微鏡(型號(hào)：H7650)購(gòu)自日本日立有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

A549細(xì)胞由上海中科院細(xì)胞庫(kù)提供。將A549細(xì)胞在含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將其置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h后，用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞完全匯合時(shí)，進(jìn)行消化傳代。傳代3次后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LY294002組、PA-MSHA干預(yù)組，LY294002組：用20 μmol/L LY294002進(jìn)行干預(yù)處理；PA-MSHA干預(yù)組：分別加入0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA進(jìn)行干預(yù)處理；空白對(duì)照組：不做任何處理。

2 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每組6個(gè)平行，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔入20 μL MTT(濃度為5 mg/mL)，37℃培養(yǎng)4h，加150 μL二甲基亞砜，低速震蕩至溶解，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm下測(cè)定吸光度(A值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組A549細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×103個(gè)/mL接種至培養(yǎng)皿中，當(dāng)克隆細(xì)胞肉眼可見(jiàn)時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用結(jié)晶紫染色、沖洗、晾干后，相機(jī)拍照并計(jì)數(shù)。各組設(shè)置6個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。細(xì)胞克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

4 透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞自噬情況

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組A549細(xì)胞，用戊二醛固定過(guò)夜，1%餓酸固定、脫水，細(xì)胞用Epon浸漬，超薄切片用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察拍照。

5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各組上樣蛋白總量為30 ug，進(jìn)行凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，封閉后孵育一抗(p62、LC3、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、β-actin抗體，1 ∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，加化學(xué)發(fā)光(ECL)液進(jìn)行顯影，定影后用Image J圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率的影響

與空白對(duì)照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率的影響

二、PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞克隆形成能力的影響

與空白對(duì)照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表2)。

圖1 PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞克隆形成能力的影響(×10)

表2 PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞克隆形成率的影響

三、PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響

與空白對(duì)照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞自噬體個(gè)數(shù)增加；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞自噬體個(gè)數(shù)減少；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞自噬體個(gè)數(shù)增加(見(jiàn)圖2)。

四、PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞p62蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞p62蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞p62蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表3)。

圖2 各組A549細(xì)胞透射電子顯微鏡圖(×8 400)

圖3 各組A549細(xì)胞p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)圖

表3 PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達(dá)的影響

五、PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖4、表4)。

圖4 各組A549細(xì)胞PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)圖

表4 PA-MSHA對(duì)A549細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表達(dá)的影響

討 論

肺癌是腫瘤疾病中發(fā)病率較高的疾病，是導(dǎo)致癌癥死亡率上升的主要原因，目前臨床治療肺癌手段主要以手術(shù)治療為主，化療為輔，隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展和對(duì)肺癌分子水平的研究，肺癌患者的生存率已有所提高[9]。PA-MSHA是通過(guò)基因工程開(kāi)發(fā)的一種生物制劑，廣泛用于多種腫瘤的輔助治療，王光林等[10]研究顯示，PA-MSHA治療結(jié)直腸癌惡性腹腔積液能取得較好的近期療效，并能改善患者生活質(zhì)量，且療效優(yōu)于順鉑。Zhang等[11]研究顯示，PA-MSHA可以改善細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的功能，可有效治療惡性腫瘤。Zhao等[12]研究顯示，PA-MSHA可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，PA-MSHA干預(yù)處理組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞克隆形成率顯著降低，且2.0×109/mL PA-MSHA組較0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞克隆形成率顯著降低，提示PA-MSHA可以抑制肺癌A549細(xì)胞增殖且呈劑量依賴(lài)。

自噬是一種分解代謝過(guò)程，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，可保護(hù)細(xì)胞和生物體免受應(yīng)激源的侵害，自噬不僅維持細(xì)胞的正常生理，在癌癥的病理過(guò)程中也起核心作用[13-14]。Ravanan等[15]研究顯示，抑制自噬有助于治療癌癥。Xu等[16]研究顯示，PA-MSHA可以刺激乳腺癌細(xì)胞自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，PA-MSHA干預(yù)組細(xì)胞自噬體個(gè)數(shù)增加，且2.0×109/mL PA-MSHA組較0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細(xì)胞自噬體個(gè)數(shù)增加，提示PA-MSHA可以促進(jìn)A549細(xì)胞自噬且呈劑量依賴(lài)。LC3是一種自噬標(biāo)記蛋白，p62是細(xì)胞自噬受體蛋白，在自噬過(guò)程中，LC3-II是反映細(xì)胞自噬活性的關(guān)鍵指示蛋白。在自噬過(guò)程中被自噬體降解，p62蛋白表達(dá)與自噬活性成反比，可以間接反映自噬活性[17]。因此，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)LC3和p62表達(dá)以反映自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，PA-MSHA干預(yù)組細(xì)胞p62蛋白表達(dá)顯著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高，呈劑量依賴(lài)，與方彪彪等[18]研究結(jié)果一致，提示PA-MSHA可以通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白p62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ表達(dá)，促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞自噬。

PI3K/Akt信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物細(xì)胞處于腫瘤抑制、氧化應(yīng)激、感染等條件時(shí)調(diào)節(jié)自噬的主要途徑。Xue等[19]研究顯示，抑制PI3K / Akt / mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，PA-MSHA干預(yù)組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著降低，且呈劑量依賴(lài)，提示在肺癌A549細(xì)胞中PA-MSHA可以抑制PI3K、Akt磷酸化蛋白表達(dá)，推測(cè)PA-MSHA可能通過(guò)抑制PI3K/Akt通路激活，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞自噬。LY294002是PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑，伍宏山等[20]研究顯示，LY294002通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路降低人A549細(xì)胞的自噬活性、增殖、遷徙和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，2.0×109/mL PA-MSHA組與LY294002組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞克隆形成率、細(xì)胞自噬體個(gè)數(shù)、p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異，提示2.0×109/mL PA-MSHA與LY294002在肺癌細(xì)胞中作用效果一致，進(jìn)一步提示PA-MSHA對(duì)肺癌A549細(xì)胞活性、自噬的影響，可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，PA-MSHA可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt通路抑制PI3K、Akt磷酸化，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白p62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ表達(dá)，促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖，但PA-MSHA對(duì)肺癌細(xì)胞自噬的具體作用機(jī)制及其是否具有臨床治療作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。