銅綠假單胞菌注射液對肺癌A549細胞自噬及PI3K/Akt通路的影響

趙智 董仁松

隨著社會的發展，環境和生活方式的不斷改變，肺癌的發病率逐年上升，嚴重危害人們的生命健康[1-2]。自噬是細胞的一種程序性死亡方式，目前大量研究顯示，自噬在腫瘤的發生發展和臨床診治中起著重要作用[3-5]，通過影響鼻咽癌細胞自噬行為可以增強其對放療的敏感性[6]。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K) /蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路與腫瘤發生、發展密切相關，通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性，抑制肺癌細胞增殖，誘導細胞自噬和凋亡[7]，通過對PI3K/AKT信號通路的研究，可以有效找到肺癌臨床預防和治療的新藥物。銅綠假單胞菌注射液(pseudomonas aeruginosa，PA-MSHA)可用于癌癥的臨床治療，研究顯示PA-MSHA可以抑制肺癌細胞增殖并促進其凋亡[8]，然而關于PA-MSHA對肺癌細胞自噬的影響及其作用機制研究報道較少。本研究通過觀察PA-MSHA對肺癌A549細胞增殖、自噬的影響，探討其可能的作用機制，為肺癌的臨床診治提供一定理論基礎。

資料與方法

一、主要試劑及儀器

DMEM培養基(貨號：31600034)購自美國Gibco公司；LY294002(貨號：PHZ1144)購自中國賽默飛世爾公司；PA-MSHA(國藥準字S20043022)購自北京萬特爾生物制藥有限公司；MTT試劑盒(貨號：GM01-500T)購自上海歌凡生物科技有限公司；PI3K抗體(貨號：ab32089)、AKT抗體(貨號：ab38449)、p-AKT抗體(貨號：ab8805)、p62抗體(貨號：91526)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體(貨號：ab51520)購自abcam公司；p-PI3K抗體(貨號：kl-6417R)購自中國康朗生物公司；辣根過氧化物酶標記的二抗(貨號：BHR101)購自北京博爾西科技有限公司；蛋白電泳及電轉移裝置(型號：AU5800)購自北京市六一儀器廠；CO2培養箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶聯免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司；通過透射電子顯微鏡(型號：H7650)購自日本日立有限公司。

二、實驗方法

1 細胞培養及分組

A549細胞由上海中科院細胞庫提供。將A549細胞在含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中培養，將其置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中，培養12 h后，用顯微鏡觀察細胞生長狀態，當細胞完全匯合時，進行消化傳代。傳代3次后，取對數生長期細胞，隨機分為空白對照組、LY294002組、PA-MSHA干預組，LY294002組：用20 μmol/L LY294002進行干預處理；PA-MSHA干預組：分別加入0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA進行干預處理；空白對照組：不做任何處理。

2 MTT法檢測各組細胞活性

收集對數生長期的各組A549細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL接種于96孔板中，每組6個平行，37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養48 h后，每孔入20 μL MTT(濃度為5 mg/mL)，37℃培養4h，加150 μL二甲基亞砜，低速震蕩至溶解，用酶標儀在波長570 nm下測定吸光度(A值)，實驗重復6次，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

3 平板克隆形成實驗檢測各組細胞增殖能力

收集對數生長期的各組A549細胞，調整濃度為1×103個/mL接種至培養皿中，當克隆細胞肉眼可見時，棄去培養基，用結晶紫染色、沖洗、晾干后，相機拍照并計數。各組設置6個平行，實驗重復6次。細胞克隆形成率=克隆形成數/接種細胞數×100%。

4 透射電子顯微鏡觀察各組細胞自噬情況

收集對數生長期的各組A549細胞，用戊二醛固定過夜，1%餓酸固定、脫水，細胞用Epon浸漬，超薄切片用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察拍照。

5 Western blot檢測各組細胞中自噬相關蛋白及PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調整各組上樣蛋白總量為30 ug，進行凝膠電泳分離后，轉膜，封閉后孵育一抗(p62、LC3、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、β-actin抗體，1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，次日加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，加化學發光(ECL)液進行顯影，定影后用Image J圖像分析軟件進行半定量分析，以β-actin為內參，計算各蛋白相對表達量。

三、統計學方法

結 果

一、PA-MSHA對A549細胞增殖抑制率的影響

與空白對照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)(見表1)。

表1 PA-MSHA對A549細胞增殖抑制率的影響

二、PA-MSHA對A549細胞克隆形成能力的影響

與空白對照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)(見圖1、表2)。

圖1 PA-MSHA對A549細胞克隆形成能力的影響(×10)

表2 PA-MSHA對A549細胞克隆形成率的影響

三、PA-MSHA對A549細胞自噬的影響

與空白對照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細胞自噬體個數增加；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細胞自噬體個數減少；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細胞自噬體個數增加(見圖2)。

四、PA-MSHA對A549細胞自噬相關蛋白p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達的影響

與空白對照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細胞p62蛋白表達顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細胞p62蛋白表達顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細胞p62蛋白表達顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著升高(P<0.05)(見圖3、表3)。

圖2 各組A549細胞透射電子顯微鏡圖(×8 400)

圖3 各組A549細胞p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達圖

表3 PA-MSHA對A549細胞自噬相關蛋白p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達的影響

五、PA-MSHA對A549細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表達的影響

與空白對照組相比，LY294002組、0.5×109/mL、1.0×109/mL、2.0×109/mL PA-MSHA組細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與LY294002組相比，0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組相比，2.0×109/mL PA-MSHA組細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低(P<0.05)(見圖4、表4)。

圖4 各組A549細胞PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達圖

表4 PA-MSHA對A549細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表達的影響

討 論

肺癌是腫瘤疾病中發病率較高的疾病，是導致癌癥死亡率上升的主要原因，目前臨床治療肺癌手段主要以手術治療為主，化療為輔，隨著醫療水平的不斷發展和對肺癌分子水平的研究，肺癌患者的生存率已有所提高[9]。PA-MSHA是通過基因工程開發的一種生物制劑，廣泛用于多種腫瘤的輔助治療，王光林等[10]研究顯示，PA-MSHA治療結直腸癌惡性腹腔積液能取得較好的近期療效，并能改善患者生活質量，且療效優于順鉑。Zhang等[11]研究顯示，PA-MSHA可以改善細胞因子誘導的殺傷細胞的功能，可有效治療惡性腫瘤。Zhao等[12]研究顯示，PA-MSHA可以抑制非小細胞肺癌細胞增殖，誘導其凋亡。本研究發現，與空白對照組相比，PA-MSHA干預處理組細胞增殖抑制率顯著升高，細胞克隆形成率顯著降低，且2.0×109/mL PA-MSHA組較0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細胞增殖抑制率顯著升高，細胞克隆形成率顯著降低，提示PA-MSHA可以抑制肺癌A549細胞增殖且呈劑量依賴。

自噬是一種分解代謝過程，在維持細胞內穩態中發揮重要作用，可保護細胞和生物體免受應激源的侵害，自噬不僅維持細胞的正常生理，在癌癥的病理過程中也起核心作用[13-14]。Ravanan等[15]研究顯示，抑制自噬有助于治療癌癥。Xu等[16]研究顯示，PA-MSHA可以刺激乳腺癌細胞自噬。本研究發現，與空白對照組相比，PA-MSHA干預組細胞自噬體個數增加，且2.0×109/mL PA-MSHA組較0.5×109/mL、1.0×109/mL PA-MSHA組細胞自噬體個數增加，提示PA-MSHA可以促進A549細胞自噬且呈劑量依賴。LC3是一種自噬標記蛋白，p62是細胞自噬受體蛋白，在自噬過程中，LC3-II是反映細胞自噬活性的關鍵指示蛋白。在自噬過程中被自噬體降解，p62蛋白表達與自噬活性成反比，可以間接反映自噬活性[17]。因此，通過免疫印跡檢測LC3和p62表達以反映自噬水平。本研究發現，與空白對照組相比，PA-MSHA干預組細胞p62蛋白表達顯著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著升高，呈劑量依賴，與方彪彪等[18]研究結果一致，提示PA-MSHA可以通過調節自噬相關蛋白p62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ表達，促進肺癌A549細胞自噬。

PI3K/Akt信號通路是哺乳動物細胞處于腫瘤抑制、氧化應激、感染等條件時調節自噬的主要途徑。Xue等[19]研究顯示，抑制PI3K / Akt / mTOR信號傳導途徑可以誘導胰腺癌細胞自噬。本研究發現，與空白對照組相比，PA-MSHA干預組細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，且呈劑量依賴，提示在肺癌A549細胞中PA-MSHA可以抑制PI3K、Akt磷酸化蛋白表達，推測PA-MSHA可能通過抑制PI3K/Akt通路激活，調節自噬相關蛋白表達，促進A549細胞自噬。LY294002是PI3K/Akt信號通路抑制劑，伍宏山等[20]研究顯示，LY294002通過抑制PI3K/Akt信號通路降低人A549細胞的自噬活性、增殖、遷徙和侵襲。本研究發現，2.0×109/mL PA-MSHA組與LY294002組細胞增殖抑制率、細胞克隆形成率、細胞自噬體個數、p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達均無顯著性差異，提示2.0×109/mL PA-MSHA與LY294002在肺癌細胞中作用效果一致，進一步提示PA-MSHA對肺癌A549細胞活性、自噬的影響，可能是通過調控PI3K/Akt通路實現的。

綜上所述，PA-MSHA可能通過調控PI3K/Akt通路抑制PI3K、Akt磷酸化，調節自噬相關蛋白p62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ表達，促進肺癌A549細胞自噬，抑制細胞增殖，但PA-MSHA對肺癌細胞自噬的具體作用機制及其是否具有臨床治療作用仍需進一步驗證。