漢黃芩素調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路并誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡及周期阻滯的作用及機(jī)制研究

廉政君 常煒

肺癌是指起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制與吸煙、電離輻射、大氣污染等因素密切相關(guān)。由于肺癌發(fā)病初期臨床特征并不明顯，常被忽視或誤診，且目前治療手段有限，導(dǎo)致近年來(lái)肺癌患者的死亡率呈逐年升高趨勢(shì)[1-6]。JAK/STAT信號(hào)通路是細(xì)胞發(fā)育、生長(zhǎng)、增殖等生理活動(dòng)不可缺少的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明，腫瘤及心血管損傷等多種疾病的發(fā)病機(jī)制與JAK/STAT信號(hào)通路的異常表達(dá)有關(guān)[7-10]。近年來(lái)研究表明，肺癌的發(fā)病機(jī)制與JAK/STAT信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白的異常激活密切相關(guān)[11-13]。漢黃芩素是從中藥材黃芩中提取分離得到的單體化合物，研究表明其具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[14-17]，而漢黃芩素對(duì)于肺癌A549細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路及其細(xì)胞周期的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)研究漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡、周期及對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，以期為肺癌的臨床治療提供新的參考和依據(jù)。

資料與方法

一、材料

肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；漢黃芩素購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；JAK2、STAT3和GAPDH抗體均購(gòu)自Proteintech公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購(gòu)自Promega公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自北京島津公司；雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

二、 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

從-80℃冰箱中取出A549細(xì)胞凍存管，于37℃恒溫水浴箱輕輕搖動(dòng)，溶解后移至超凈工作臺(tái)，用移液槍吸出管內(nèi)細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至10 mL無(wú)菌離心管中，加入適量的DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，800 r/min條件下離心5 min。棄去上清，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打使細(xì)胞重懸，并小心接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%進(jìn)行傳代。

三、 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

在96孔板上分別設(shè)置漢黃芩素低、中、高劑量組、對(duì)照組及調(diào)零組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。調(diào)零組只加入等量培養(yǎng)液，不加入細(xì)胞懸液，其余各組加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，并使其密度為1×104個(gè)/mL。各組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后對(duì)照組及調(diào)零組更換新鮮培養(yǎng)液，漢黃芩素低、中、高劑量組分別加入終濃度為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的漢黃芩素，并繼續(xù)于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在避光的環(huán)境下每孔加入20μl MTT溶液(5 mg/mL)，于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，然后輕輕吸去上清液，每孔加入150μlDMSO，置于振蕩器上震蕩5 min至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定OD值。按照如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=1-[漢黃芩素各劑量組(OD均值)-調(diào)零組(OD均值)]/[對(duì)照組(OD均值)-調(diào)零組(OD均值)]×100%。

四、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組肺癌A549細(xì)胞中JAK2、STAT3 mRNA水平

取對(duì)照組及20、40、80 μmol/L的漢黃芩素作用48 h的A549細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒，分別提取各組肺癌A549細(xì)胞的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組A549細(xì)胞中GAPDH、JAK2、STAT3 mRNA水平。各檢測(cè)基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物(見(jiàn)表1)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的基因引物序列

五、AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度成1×104個(gè)/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，漢黃芩素各劑量組分別加入終濃度為20、40、80 μmol/L的漢黃芩素，然后將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h后，使用PBS洗滌細(xì)胞，加入適量不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞并以1000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，以2000 rpm離心5 min，棄上清液，加入195μl AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5μl的AnnexinV-FITC混勻后，避光，室溫(20～25℃)孵育15 min，然后加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組A549細(xì)胞凋亡情況。

六、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)漢黃芩素對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，漢黃芩素各劑量組分別加入終濃度為20、40、80μmol/L的漢黃芩素，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組A549細(xì)胞，，用1×PBS洗2遍后去除PBS，加入預(yù)冷的70%乙醇固定，過(guò)夜。次日取出，離心(2500 rpm，5 min，4℃)，用移液槍吸去上清液，渦旋震蕩使A549細(xì)胞松散。用1×PBS洗滌A549細(xì)胞兩次，然后加入已配好的碘化丙啶染色液，37°C染色30 min后，利用流式細(xì)胞儀，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

七、Western blot檢測(cè)漢黃芩素對(duì)A549細(xì)胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，漢黃芩素各劑量組分別加入終濃度為20、40、80μmol/L的漢黃芩素，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組A549細(xì)胞，分別加入裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，處理好待測(cè)樣品后，取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h后，經(jīng)PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3及GAPDH抗體(1:1000)孵育，4℃過(guò)夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1:2000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

八、數(shù)據(jù)處理

結(jié) 果

一、漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用

各組肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制率(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組肺癌A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h的增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，且隨著漢黃芩素劑量的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，漢黃芩素對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，提示漢黃芩素能夠呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性的顯著抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。同時(shí)，漢黃芩素作用于肺癌A549細(xì)胞48 h后即可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖(P<0.05)，故選擇漢黃芩素作用于肺癌A549細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 各組肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制率

二、漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞JAK2、STAT3mRNA水平的影響

各組肺癌A549細(xì)胞JAK2、STAT3mRNA水平(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組A549細(xì)胞JAK2、STAT3mRNA水平均顯著降低(P<0.05)，且肺癌A549細(xì)胞JAK2、STAT3mRNA水平隨漢黃芩素劑量的增加而逐漸降低。

圖1 各組肺癌A549細(xì)胞JAK2、STAT3mRNA水平

三、漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

各組肺癌A549細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組A549細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，同時(shí)，隨著漢黃芩素劑量的增加，肺癌A549細(xì)胞凋亡率逐漸升高，即表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。

四、漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞周期的影響

各組肺癌A549細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，漢黃芩素低、中、高劑量組G2/M期A549細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，且G2/M期肺癌A549細(xì)胞比例隨著漢黃芩素劑量的增加而逐漸升高。

五、漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平的影響

各組肺癌A549細(xì)胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平JAK2、STAT3水平見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，漢黃芩素各劑量組肺癌A549細(xì)胞Chk1水平不存在顯著性差異(P>0.05)，p-Chk1、P53、Bax水平顯著升高(P<0.05)， CyclinB1、PCNA、Bcl-2、Survivin、JAK2、STAT3水平均顯著降低(P<0.05)，且隨著漢黃芩素劑量的增加，肺癌A549細(xì)胞p-Chk1、P53、Bax水平逐漸升高，CyclinB1、PCNA、Bcl-2、Survivin、JAK2、STAT3水平逐漸降低(見(jiàn)圖4)。

圖2 各組肺癌A549細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖3 各組肺癌A549細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖4 各組肺癌A549細(xì)胞PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin、Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1、JAK2、STAT3水平、JAK2、STAT3水平

討 論

肺癌是臨床常見(jiàn)的發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，研究表明，肺癌的發(fā)病機(jī)制與年齡、性別、職業(yè)、大氣污染等多種因素密切相關(guān)[1-3]。由于肺癌存在直接擴(kuò)散、血行轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移等多種播散轉(zhuǎn)移途徑，這給肺癌的治療增加了難度，目前臨床上對(duì)于肺癌的治療，主要采用放療、化療及免疫治療等手段[4-6]，但由于這些治療手段存在不良反應(yīng)大、易出現(xiàn)耐藥等多種缺點(diǎn)，對(duì)于治療肺癌藥物的研發(fā)仍是當(dāng)前的工作重點(diǎn)之一。

JAK/STAT信號(hào)通路是與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等生理活動(dòng)及功能密切相關(guān)的重要信號(hào)通路之一。研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路的異常表達(dá)與胃癌、心肌損傷及神經(jīng)損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-10]。近年來(lái)，研究表明JAK/STAT信號(hào)通路在肺癌的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)抑制肺癌細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路及相關(guān)蛋白的過(guò)度激活，能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[11-13]。

漢黃芩素是從傳統(tǒng)中藥材黃芩中提取得到的單體化合物，研究表明，其具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、血管保護(hù)等多種藥理作用[14-15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，漢黃芩素能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[16-17]，但其對(duì)肺癌A549細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路、細(xì)胞周期及凋亡的影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文通過(guò)研究不同濃度的漢黃芩素對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及細(xì)胞周期的影響。PCNA、Bax、Bcl-2、Survivin是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，PCNA在啟動(dòng)細(xì)胞增殖的生命過(guò)程中起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)，Bax是促凋亡基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Survivin能夠抑制下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，起抗凋亡作用。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，漢黃芩素各劑量組肺癌A549細(xì)胞24 h、48、72 h增殖抑制率顯著升高，且表現(xiàn)出劑量及時(shí)間依賴(lài)性，提示漢黃芩素能夠呈劑量及時(shí)間依賴(lài)性的顯著抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，同時(shí)結(jié)果表明，不同濃度的漢黃芩素作用于肺癌A549細(xì)胞48 h后，漢黃芩素各劑量組肺癌A549細(xì)胞，凋亡率顯著升高，A549細(xì)胞遷移率及凋亡率且隨著漢黃芩素劑量的增加而變化，A549細(xì)胞Bax 水平顯著升高，PCNA、、Bcl-2、Survivin水平顯著降低，表明漢黃芩素能夠促進(jìn)A549細(xì)胞促凋亡基因的表達(dá)，抑制抗凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其促凋亡作用；Chk1、p-Chk1、P53、CyclinB1是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期的基因，Chk1通過(guò)磷酸化的方式阻斷細(xì)胞有絲分裂，P53作為抑癌基因，能夠抑制下游CyclinB1基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞分裂的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，漢黃芩素各劑量組A549細(xì)胞G2/M期比例顯著升高，漢黃芩素各劑量組A549細(xì)胞Chk1水平無(wú)明顯差異，而p-Chk1及P53水平顯著升高，CyclinB1水平顯著降低，提示漢黃芩素能夠呈劑量依賴(lài)性的促進(jìn)A549細(xì)胞Chk1蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂，同時(shí)促進(jìn)抗癌基因P53的表達(dá)，抑制其下游CyclinB1基因的表達(dá)，干擾A549細(xì)胞正常分裂周期，誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞G2/M期阻滯，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)及Western blot結(jié)果表明，漢黃芩素各劑量組A549細(xì)胞JAK2及STAT3 mRNA水平、JAK2及STAT3水平均隨著漢黃芩素劑量的增加而逐漸降低，且與對(duì)照組相比，漢黃芩素各劑量組A549細(xì)胞JAK2及STAT3 mRNA水平、JAK2及STAT3水平均顯著降低，表明漢黃芩素能夠呈劑量依賴(lài)性的降低肺癌A549細(xì)胞JAK2及STAT3水平，抑制JAK/STAT信號(hào)通路的異常激活。

綜上所述，漢黃芩素能夠抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖及遷移能力，誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡及G2/M周期阻滯，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路有關(guān)。