miR-1226靶向MUC1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響

冀國(guó)發(fā) 胡靜怡 任徽

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，約占肺癌的80%～85%左右[1-2]。NSCLC的主要治療手段有外科手術(shù)、化療和靶向治療等，而以表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)為靶點(diǎn)的藥物治療，如吉非替尼等，已成為晚期NSCLC治療的重要手段，但幾乎所有患者在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)產(chǎn)生耐藥性[3-4]。因此，深入探索NSCLC治療的耐藥機(jī)制，具有臨床研究意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是保守的非編碼小分子RNA，參與調(diào)控基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及產(chǎn)生耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。Zhou等[6]研究發(fā)現(xiàn)miR-1226可能與乳腺癌細(xì)胞中他莫昔芬的耐藥性相關(guān)，但其是否對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞吉非替尼敏感性有影響尚不清楚。本研究旨在探討miR-1226過(guò)表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株吉非替尼敏感性的影響，并初步研究其對(duì)MUC1基因的靶向調(diào)控作用，為臨床提供理論參考。

資料與方法

一、主要材料與儀器

NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9GR(CM-2052)、PC-9(CM-1732)購(gòu)自上海名勁生物科技有限公司；吉非替尼購(gòu)自英國(guó)Astra Zeneea公司；1640培養(yǎng)基(含雙抗)(31800)、胎牛血清(11011-8611)、胰蛋白酶消化液(0.25%)(T1350)、MTT噻唑藍(lán)(M8180)、高效RIPA裂解液(R0010)、Trizol試劑盒(15596-018)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(T2210-200T)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Scipu004231)購(gòu)自無(wú)錫耐思生物科技有限公司；96孔細(xì)胞板(Scipu000969)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；miR-1226 mimic、miR-1226 NC由廣州銳博生物生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)；miR-1226、MUC1、U6、β-肌動(dòng)蛋白引物均由上海生工生物工程有限公司合成；磷酸鹽緩沖液(PBS)(C0221A)、ECL發(fā)光液(P0018FS)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；MUC1兔單克隆抗體(EP1024Y)購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)；Matrigel膠(356230)購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司；PCR儀(5333型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；酶標(biāo)儀(ELX-8081U)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(51032878)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；倒置顯微鏡(MA100N)購(gòu)自日本Nikon。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

將購(gòu)買(mǎi)的PC9GR、PC-9細(xì)胞分別置于37℃水浴鍋中解凍、離心(1 200 r/min，5 min)、棄去上清液，用1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后收集、用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

收集1.2.1培養(yǎng)的PC9GR細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-1226 mimic組、miR-1226 NC組，并接種至六孔板上(密度：1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)6～8 h。將miR-1226 mimic儲(chǔ)存液及l(fā)ipo2000轉(zhuǎn)染液使用無(wú)胎牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋后，添加至miR-1226 mimic各組；按照上述方法，向miR-1226 NC組細(xì)胞孔板中添加miR-1226 NC稀釋液和lipo2000轉(zhuǎn)染稀釋液；對(duì)照組不做任何處理。將以上各組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中孵化6 h，更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另收集1.2.1培養(yǎng)的PC-9細(xì)胞，設(shè)為正常組，培養(yǎng)相同時(shí)間，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別提取1.2.2收集的各組細(xì)胞總RNA，以總RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并對(duì)miR-1226、MUC1進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，40次循環(huán)，分別以U6、β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，檢測(cè)各組miR-1226、MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。miR-1226、 MUC1 mRNA、U6和β-肌動(dòng)蛋白引物序列(見(jiàn)表1)。

4 MTT實(shí)驗(yàn)

分別收集1.2.2中各組細(xì)胞，用1640完全培養(yǎng)基重懸后，接種于96孔板(4×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)8 h后，棄去上清液，各組分別加入不同濃度的吉非替尼(0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)處理24 h，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，避光保存4 h，加入100 μL 二甲基亞砜，37℃條件下震蕩10 min，在波長(zhǎng)為490 nm時(shí)測(cè)量各組吸光值(OD值)，并計(jì)算各組半數(shù)抑制率IC50。

表1 miR-1226、MUC1、β-肌動(dòng)蛋白、U6引物序列

5 蛋白免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)

收集1.2.2各組細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液，分別提取各組細(xì)胞總蛋白。取等量蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，37℃下，使用5%脫脂奶粉封閉4 h，依次加入MUC1(1 ∶1 000)、β-肌動(dòng)蛋白(1 ∶2 000)，室溫?fù)u床孵化過(guò)夜，洗膜后加入二抗(1 ∶2 000)，室溫孵化2 h。以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，利用Image-J處理圖片。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，計(jì)算MUC1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel膠以1 ∶8比例稀釋，低溫條件下鋪于小室上層，室溫過(guò)夜。收集1.2.2中各組細(xì)胞，用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基重懸后，接種至上室(1×105個(gè)/孔)，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，同時(shí)向Transwell小室下室加入300 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出小室，用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色25 min，PBS漂洗5 min，分別隨機(jī)抽取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)。

7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將合成的MUC1 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)miR-1226識(shí)別序列，克隆至pmiRGlo載體，得pmiRGlo-MUC1-3′UTR-WT。另外對(duì)miR-1226識(shí)別區(qū)MUC1堿基進(jìn)行突變連接至pmiRGlo載體得pmiRGlo-MUC1-3′UTR-MUT。按照l(shuí)ipo2000試劑說(shuō)明書(shū)操作步驟，分別將pmiRGlo-MUC1-3′UTR-WT、pmiRGlo-MUC1-3′UTR-MUT質(zhì)粒與miR-1226 mimic、miR-1226 NC共轉(zhuǎn)染24 h。根據(jù)試劑盒計(jì)數(shù)手冊(cè)操作，記錄螢火蟲(chóng)和海參熒光素酶試劑激發(fā)值，每孔數(shù)值以螢火蟲(chóng)熒光活性/海參熒光活性顯示。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、miR-1226在各組細(xì)胞中表達(dá)情況

與正常組PC-9細(xì)胞相比，對(duì)照組和miR-1226 NC組PC9GR細(xì)胞miR-1226表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組和miR-1226 NC組相比，miR-1226 mimic組PC9GR細(xì)胞miR-1226表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 各組細(xì)胞中miR-1226表達(dá)情況

二、miR-1226 mimic轉(zhuǎn)染對(duì)PC9GR細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響

與正常組相比，對(duì)照組和miR-1226 NC組PC9GR細(xì)胞IC50值顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組和miR-1226 NC組相比，miR-1226 mimic組PC9GR細(xì)胞IC50值顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 miR-1226 mimic轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞IC50比較

三、miR-1226 mimic轉(zhuǎn)染對(duì)PC9GR細(xì)胞侵襲能力的影響

與正常組相比，對(duì)照組和miR-1226 NC組PC9GR細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組和miR-1226 NC組相比，miR-1226 mimic組PC9GR細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表4)。

表4 miR-1226 mimic轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞侵襲數(shù)量

圖1 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞侵襲能力圖(×200)

A:正常組；B:對(duì)照組；C：miR-1226 NC組；D：miR-1226 mimic組

四、miR-1226 mimic轉(zhuǎn)染對(duì)PC9GR細(xì)胞中MUC1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，對(duì)照組和miR-1226 NC組PC9GR細(xì)胞MUC1 mRNA及MUC1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組和miR-1226 NC組相比，miR-1226 mimic組PC9GR細(xì)胞MUC1 mRNA及MUC1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 miR-1226 mimic轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞MUC1 mRNA及MUC1表達(dá)變化

圖2 miR-1226與MUC1 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

五、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-1226與MUC1靶向關(guān)系

經(jīng)microrna.org數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-1226與MUC1 3′UTR有結(jié)合位點(diǎn)。基因檢測(cè)顯示，與MUC1-3′UTR-WT+miR-1226 NC組比較，MUC1-3′UTR-WT+miR-1226 mimic組熒光素酶活性降低(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表6)。

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

討 論

將TKI引入NSCLC治療之前，鉑鹽聯(lián)合化療導(dǎo)致NSCLC患者生存率不足一年，而引入以TKIs為代表的EGFR抑制劑，使NSCLC的生存率得到極大提升[7-8]。研究表明，TKIs可通過(guò)干擾酪氨酸激酶活化抑制相關(guān)蛋白質(zhì)活性[9]。目前，EGFR-TKIs藥物治療是具有EGFR敏感性突變的晚期NSCLC患者的重要臨床治療方式，而吉非替尼作為第三代EGFR-TKIs，在EGFR突變細(xì)胞中具有更高活性，然而晚期NSCLC患者易出現(xiàn)耐藥性，為臨床研究帶來(lái)新的挑戰(zhàn)[10]。

miRNA是參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，臨床上通常將miRNA表達(dá)失調(diào)作為癌癥發(fā)病的標(biāo)志之一[11]。研究表明，與正常肺組織和其他肺癌組織相比，miRNA在NSCLC中的表達(dá)存在顯著差異，且參與調(diào)控NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性[12]。范洪瑋等[13]研究表明，miRNA異常表達(dá)與乳腺癌侵襲、耐藥相關(guān)；汪洋等[14]發(fā)現(xiàn)，miRNA-299-3p可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性。Borkowski等[15]發(fā)現(xiàn)，抑制miR-1226基因表達(dá)，能夠特異性下調(diào)miR-17～92多順?lè)醋樱种婆cNSCLC不良患者預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞色素P450 24A1抗體的表達(dá)，進(jìn)而影響患者預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和miR-1226 NC組相比，miR-1226 mimic組PC9GR細(xì)胞miR-1226表達(dá)水平顯著升高，提示miR-1226 mimic轉(zhuǎn)染成功。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，對(duì)照組和miR-1226 NC組PC9GR細(xì)胞IC50值顯著升高，提示PC9GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼藥物敏感性低于PC-9細(xì)胞；與對(duì)照組和miR-1226 NC組相比，miR-1226 mimic組PC9GR細(xì)胞IC50值及細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低，表明過(guò)表達(dá)miR-1226可提高PC9GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼藥物的敏感性。

MUC1是一種黏蛋白，與肝癌、舌癌等腫瘤的侵襲行為密切相關(guān)[16]。研究表明，MUC1介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和黏附，在大多數(shù)癌癥和某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤中異常表達(dá)[17-18]。付紅艷等[19]臨床研究發(fā)現(xiàn)，MUC1蛋白在NSCLC患者中高表達(dá)，對(duì)肺腺癌患者的早期診斷具有預(yù)測(cè)意義。目前，多種靶向MUC1腫瘤疫苗已廣泛用于臨床試驗(yàn)，其中病毒載體疫苗TG4010聯(lián)合化療已被證實(shí)能夠使晚期NSCLC患者顯著獲益[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，對(duì)照組和miR-1226 NC組PC9GR細(xì)胞MUC1 mRNA及MUC1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，提示MUC1蛋白可能與NSCLC細(xì)胞株的吉非替尼敏感性相關(guān)。Jin等[21]研究表明，miR-1226通過(guò)下調(diào)MUC1蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組和miR-1226 NC組相比，miR-1226 mimic組PC9GR細(xì)胞MUC1 mRNA及MUC1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，提示過(guò)表達(dá)miR-1226，能夠下調(diào)MUC1蛋白表達(dá)。另外，經(jīng)microrna.org數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-1226與MUC1 3′UTR有結(jié)合位點(diǎn)。與MUC1-3′UTR-WT+miR-1226 NC組比較，MUC1-3′UTR-WT+miR-1226 mimic組熒光素酶活性降低，提示miR-1226與MUC1存在直接靶向關(guān)系，推測(cè)miR-1226可能靶向抑制MUC1表達(dá)，提高NSCLC細(xì)胞株對(duì)吉非替尼敏感性。

綜上所述，miR-1226過(guò)表達(dá)可能通過(guò)靶向抑制MUC1表達(dá)，提高NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性，可能為NSCLC的臨床治療提供參考。但由于NSCLC患者的臨床治療與體外腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)存在一定差異，miR-1226對(duì)NSCLC細(xì)胞的吉非替尼敏感性調(diào)控機(jī)制仍需更深一步的探索。