超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛組織中常山酮殘留量

（漯河食品職業(yè)學院，河南 漯河 462300）

常山酮（halofuginone）屬于人工合成的一種廣譜抗球蟲藥，是一種從植物常山中分離出來的常山堿的鹵代衍生物[1]，其氫溴酸鹽治療效果較好、副作用較少，且不易產(chǎn)生交叉耐藥性，被廣泛用來防治畜禽的球蟲病[2-3]。常山酮主要在肝臟進行代謝，在組織中降解較快[4]，孫曉娟等[5]、吳寧鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)常山酮的休藥期為5 d，為此，在用藥過程中，應嚴格執(zhí)行其休藥期，確保動物性食品的安全[7]。目前，常山酮在畜禽養(yǎng)殖上已大量使用，因此，建立可靠的牛組織中常山酮殘留量的檢測方法，科學推測其休藥期，保證食品安全顯得尤為重要。

目前，常山酮殘留量的檢測方法主要包括液相色譜法[8-11]、酶聯(lián)免疫法[12-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]等。在動物性食品中，常山酮殘留量檢測的相關(guān)國家標準方法[17-18]均為液相色譜法。依據(jù)GB 29693—2013《食品安全國家標準動物性食品中常山酮殘留量的測定高效液相色譜法》和SN 0643—1997《出口肉及肉制品中溴氯常山酮殘留量檢驗方法》，動物性食品中的常山酮殘留量的檢測定量限均為50μg/kg，而GB31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》[19]中要求牛組織中常山酮殘留限量為10 μg/kg～30 μg/kg，因此，采用GB 29693—2013和SN 0643—1997對牛組織中常山酮的殘留量進行檢測，其定量限均無法達到牛組織中常山酮殘留限量的標準要求，本試驗對牛組織中常山酮殘留量的前處理方法進行了優(yōu)化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測，以期解決牛組織樣品中常山酮殘留限量低，國家相關(guān)檢測標準定量限達不到殘留限量標準要求的問題，將其用于牛組織、雞組織等不同基質(zhì)樣品中常山酮殘留量的快速定性和定量。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、JLSPE-12B型固相萃取裝置：Waters公司；BSA224S型電子天平、ML802E型電子天平：Mettler Toledo公司；GL-21M型離心機：湘儀離心機有限公司；VX-III型多管平行振蕩器：Targin公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置：Eyela公司；5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑和材料

除非另有說明，分析中僅使用分析純的試劑，水為符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水；氫溴酸常山酮對照品（含量≥99.6%）：中國標準物質(zhì)中心；牛肉、牛肝樣品：市售；Oasis HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL）：Waters公司；尼龍濾膜（0.22 μm）：天津津騰實驗室設(shè)備有限公司；乙酸銨、冰乙酸（均為優(yōu)級純）：上海國藥集團；甲醇、乙酸乙酯、甲酸銨、甲酸（均為色譜純）、乙腈（質(zhì)譜純）：Fisher公司。

1.3 主要溶液配制

1.3.1 0.25 mol/L乙酸銨緩沖液

稱取19.27 g乙酸銨用水溶解于1 000 mL容量瓶中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1 000 mL，用冰乙酸調(diào)pH值至4.3。

準確量取150 mL乙腈、445 mL水和5 mL冰乙酸，再加入1.73 g乙酸銨，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 20 mg/mL胰蛋白酶溶液

準確稱取20 g胰蛋白酶，用水溶解并定容至1 000 mL。

1.3.4 200 μg/mL常山酮標準儲備液

準確稱取氫溴酸常山酮對照品10.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用0.25 mol/L乙酸銨緩沖液溶解并稀釋至刻度。2℃～8℃避光保存，有效期6個月。

1.3.5 2.0 μg/mL常山酮標準儲備液

準確吸取200 μg/mL常山酮標準儲備液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。2℃～8℃避光保存，有效期3個月。

有時再談得遠一點，就是表姊表妹之類訂了婆家，或是什么親戚的女兒出嫁了。或是什么耳聞的，聽說的，新娘子和新姑爺鬧別扭之類。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：WatersBEH-C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨），B相為乙腈；流速：0.45 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：40℃；流動相及梯度洗脫條件見表1。

表1 常山酮流動相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase and gradient elution conditions of halofuginone

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子（ESI+）模式；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：3.2 kV；干燥氣流量：900 L/Hr；干燥氣溫度：450℃；錐孔反吹氣流量：40 L/Hr；檢測模式：多反應監(jiān)測（multi-reaction monitoring，MRM）模式，監(jiān)測條件如表2所示[20]。

表2 常山酮的多反應監(jiān)測（MRM）條件Table 2 Multi-reaction monitoring（MRM）conditions of halofuginone

1.5 樣品處理

1.5.1 樣品提取

稱取試樣（4.00±0.04）g于50 mL離心管中，加入10 mL 20 mg/mL胰蛋白酶溶液，渦動1 min，用10%碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8.0，渦旋混勻后于40℃水浴中酶解3 h。取出，放至室溫（20±5）℃，加入10%碳酸鈉溶液2 mL，渦動1 min，再加入乙酸乙酯20 mL，于多管平行振蕩器上振蕩5 min，0℃離心機中放置3 min，0℃環(huán)境中2000r/min離心3min，將上清液轉(zhuǎn)入100mL蒸餾瓶中，下層液用乙酸乙酯20 mL重復提取一次，合并兩次上清液[17-18]。上清液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，殘余物中加入0.125 mol/L乙酸銨緩沖溶液10 mL和水飽和正己烷10 mL，于超聲波提取器中振蕩提取1 min，轉(zhuǎn)入另一50mL離心管中，7000r/min離心5min，收集下層水相，備用。

1.5.2 樣品凈化

HLB柱依次用 3 mL甲醇、3 mL水和 3 mL 0.125 mol/L乙酸銨緩沖液活化，取全部備用液過柱，用3 mL水淋洗柱子；最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用1.0 mL流動相（1.3.2）溶解殘余物，混勻，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.5.3 基質(zhì)匹配標準曲線的配制

精密吸取2.0 μg/mL的常山酮標準儲備液適量，用甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為 0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的系列標準溶液，各取1.0 mL，分別加至經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試樣洗脫液中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用1.0 mL流動相（1.3.2）溶解殘余物，混勻，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理的優(yōu)化

試樣按1.5.1酶解并經(jīng)乙酸乙酯提取后，若采用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液反萃取，在乙酸銨緩沖液中會溶解少量乙酸乙酯，導致樣品凈化時在上樣過程中，少量乙酸乙酯將常山酮部分洗脫，從而影響檢測回收率。本試驗中，樣品酶解并經(jīng)乙酸乙酯提取后，采用旋蒸至干，然后用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液復溶，消除了乙酸乙酯對常山酮的洗脫，從而提高了檢測的回收率。

試驗表明：采用HLB固相萃取柱凈化上樣，當乙酸銨緩沖液中不含乙酸乙酯時，常山酮的回收率為90%以上；當乙酸銨緩沖液中含5%乙酸乙酯時，常山酮的回收率降至40%左右；當乙酸銨緩沖液中含10%乙酸乙酯時，常山酮基本無回收。經(jīng)優(yōu)化，本試驗采用將乙酸乙酯旋蒸至干后，再用0.125 mol/L乙酸銨緩沖液溶解殘渣，并用水飽和正己烷除脂肪，以確保凈化上樣過程中無乙酸乙酯殘留，從而大大提高檢測回收率。

為減少基質(zhì)效應，保證檢測回收率，本試驗采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量，優(yōu)化后樣品處理方法見1.5。

2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源正離子（ESI+）模式下，常山酮易得到H+形成較為穩(wěn)定的[M+H]+的分子離子。本試驗采用100 ng/mL常山酮標準溶液進行全掃描和子離子掃描，獲得常山酮的母離子掃描圖（圖1）和特征碎片離子掃描圖（圖2），并對其毛細管電壓、碎裂電壓和碰撞能量等條件進行優(yōu)化，選擇離子豐度最強的碎片離子對為定量離子對，離子豐度相對較強的離子對為定性離子對，優(yōu)化多反應監(jiān)測條件。

2.2.2 液相條件的優(yōu)化

本試驗采用BEH-C18色譜柱對常山酮進行分離，以乙腈作為流動相中的有機相，對比了水、0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）作為流動相中的水相對常山酮的峰型和靈敏度的影響。結(jié)果表明，當水相中加入微量甲酸時，常山酮的靈敏度顯著提高，而加入微量甲酸銨時，目標物的峰型變得尖銳對稱，所以最終選用0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）作為水相。經(jīng)優(yōu)化，最終選用1.4.1中液相條件對常山酮進行洗脫，采用優(yōu)化后液相條件測定的1 ng/mL常山酮標準溶液的總離子流圖和定量離子色譜圖如圖3所示。

2.3 線性方程和定量限

按1.5.3中的常山酮標準系列配制標準溶液，按1.4中建立的儀器條件進行測定。以測定峰面積Y對含量X（ng/mL）繪制標準曲線，其回歸方程為Y=18 283.5X+203.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。以基質(zhì)標準溶液3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，得到常山酮的檢出限為 0.25 μg/kg，定量限為 0.5 μg/kg。

圖1 常山酮的母離子掃描圖Fig.1 The parent ion scan of halofuginone

圖2 常山酮的特征碎片離子掃描圖Fig.2 The fragment ions scan of halofuginone

圖3 1 ng/mL常山酮標準溶液的總離子流圖和定量離子色譜圖Fig.3 The total ion chromatogram and quantitative ion chromatogram of 1 ng/mL halofuginone

2.4 加標回收率和精密度

取處理均勻的牛肉和牛肝樣品，按表3設(shè)計試驗。結(jié)果表明，牛組織中常山酮的回收率為73.2%～93.60%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5.91%～7.96%，具體結(jié)果如表3所示。

表3 牛組織中常山酮的回收率和精密度結(jié)果Table 3 The standard recovery and precision of halofuginone in bovine tissues

3 結(jié)論

本試驗建立了牛組織中常山酮殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，樣品經(jīng)胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。本方法具有檢測快速、靈敏度高、定性定量準確、雜峰干擾小、檢出限低等特點，適用于牛組織中常山酮殘留量的準確定性和定量。