原料對鹽漬泡菜細菌類群及基因功能的影響

向凡舒，龍旭霞，趙楠，侯強川，郭壯*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.四川省農業科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066）

作為一類傳統發酵蔬菜制品，泡菜可分為泡漬泡菜和鹽漬泡菜兩大類[1]。較之泡漬泡菜，鹽漬泡菜無需泡制發酵，制作工藝包括鹽漬、清洗整形、脫鹽脫水和配料鹽制等環節[2]。泡菜的制作屬厭氧自然發酵，其中蘊含的微生物類群對泡菜風味品質的形成具有重要的作用[3]，有研究指出地理環境[4]、原料[5]、制作方式[6]、發酵溫度[7]和鹽濃度[8]等因素均對泡菜微生物類群的形成具有明顯的影響。泡菜中的微生物類群主要來源于蔬菜原料表面的乳酸菌[3]，而制作泡菜的原料通常包括蘿卜、白菜、豇豆、青椒和萵苣等各類新鮮蔬菜，但由于品種、季節和產地等因素的影響，不同原料表面攜帶的乳酸菌類群可能存在差異[2]。Liang H等[5]研究表明白菜泡菜鹽水中的優勢細菌為乳酸桿菌，而混合蔬菜鹽水中的優勢細菌為乳酸桿菌和魏斯氏菌。明確泡菜中微生物類群構成是控制和提升泡菜品質的關鍵，因而探討發酵方式和原料等因素對泡菜中微生物類群的影響，對提升泡菜品質和食用安全性具有積極的意義。

位于恩施土家族苗族自治州的宣恩縣有以沙蔥（Allium mongolicum Regel）和切絲的青椒（Capsicum annuum var.grossum）為原料進行鹽漬泡菜制作的習俗。當地農戶制作發酵沙蔥的方法如下：將洗凈的沙蔥放入濃鹽水中漂洗兩遍后瀝干，加入食鹽和陳醋置于壇中密封發酵10 d左右即可制得發酵沙蔥，除無需使用濃鹽水漂洗外，發酵青椒的做法與沙蔥相同。由此可見，相同的地理環境及相似的制作工藝，為探討原料這一因素對鹽漬泡菜細菌類群的影響提供參考。

本研究采用MiSeq高通量測序技術對宣恩縣發酵沙蔥和發酵青椒樣品的細菌多樣性進行解析，同時對其細菌基因功能進行預測，進而探討原料對鹽漬泡菜細菌類群及基因功能的影響，以期為后續相關鹽漬泡菜制品生產工藝的改良提供理論指導，同時為發酵沙蔥等特色發酵蔬菜制品微生物多樣性的理論研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

發酵沙蔥和青椒樣品：市售；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物338F/806R：天一輝遠（武漢）生物科技有限公司；10倍緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：北京全式金生物技術有限公司。

Veriti FAST梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國 ABI公司；R920 型機架式服務器：美國DELL公司；164-5050基礎電泳儀：美國BIO-RAD公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

納入本研究的樣品均于2018年12月下旬采集自湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣三橋菜市場。發酵沙蔥編號為YSC1、YSC2和YSC3，發酵青椒編號為QJ1、QJ2和QJ3。所有樣品均在當地制作和銷售，樣品采集時其制作時間約在20 d～30 d。

1.2.2 基因組DNA提取、PCR擴增和高通量測序

每個樣品各取2 g，使用試劑盒提取微生物的總DNA，并參照文獻[9]中的方法進行細菌16S rRNA V3-V4區PCR擴增，PCR產物寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析

參照文獻[9]中的方法對下機序列進行質控后，將合格序列上傳至QIIME（V1.7.0）分析平臺進行微生物類群分析，依次進行序列對齊、分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）劃分[10]、序列比對[11]、系統發育樹構建[12]、α多樣性和β多樣性分析[13]。

將同一類鹽漬泡菜中平均相對含量>1.0%的門、屬和OTU，定義為優勢門、屬和OTU；若每個樣品都含有某一OTU，則將該OTU定義為核心OTU；若某一OTU在3個發酵沙蔥樣品中均存在，而在3個發酵青椒樣品中均不存在，則將其定義為發酵沙蔥樣品的獨特 OTU，反之亦然[14]。

1.2.4 基因功能預測

使用phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states（PICRUSt）軟件預測鹽漬泡菜中細菌的基因功能[15]，并參照蛋白質直系同源簇數據庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進行注釋[16]。

1.3 數據處理

使用曼惠尼（Mann-Whitney）檢驗對各α多樣性指標和各基因功能類別指標進行顯著性分析；使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對細菌群落結構和基因功能的整體差異性進行分析；使用非加權配對算術平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）聚類對兩類鹽漬泡菜的β多樣性進行分析。采用R語言實現數據的可視化。

2 結果與分析

2.1 測序情況和α多樣性分析

本研究采用MiSeq高通量測序技術對發酵沙蔥和發酵青椒的細菌類群結構進行解析，6個樣品測序共得到了225 242條序列，每個樣品平均測序深度為37 540條，其中有5條序列經對齊后比對失敗，剩余225 237條序列依據97%相似性劃分了OTU，共得到了10 213個OTU，每個樣品平均含有1 702個OTU，其中發酵沙蔥中共有7 689個OTU，發酵青椒中共有6 763個OTU。所有樣品的測序情況和各分類學地位數量見表1。

表1 樣品測序結果統計Table 1 Sequencing results of samples

由表1可知，對OTU中代表性序列進行同源性比對，將所有序列鑒定為26個門、64個綱、105個目、204個科和444個屬，不能鑒定到門和屬的序列數分別占總序列的0.18%和11.96%。經Mann-Whitney檢驗發現，發酵沙蔥超1指數和香農指數均顯著偏高（P<0.05），因而其細菌的豐度和多樣性均高于發酵青椒。制作發酵青椒所使用的辣椒品種為二荊條，其辣度在5 000～15 000史高維爾指標（scoville heat units，SHU），其中含有的辣椒素和辣椒堿等活性成分具有一定的抑菌作用，這可能是導致其細菌豐度和多樣性低的主要原因[17]。Jeong等[18]的研究亦表明，在泡菜中添加辣椒粉會影響泡菜在發酵初期微生物的演替和代謝產物的產生，從而導致泡菜發酵過程減慢。

2.2 β多樣性分析

本研究進一步采用基于UniFrac距離的加權和非加權UPGMA對兩類鹽漬泡菜菌群差異性進行了分析見圖1。

圖1 基于OTU水平加權和非加權UniFrac距離的UPGMAFig.1 UPGMA based on weighted and unweighted UniFrac distance at OTU lever

由圖1A可知，除QJ1和QJ2形成一個聚類外，其他同類樣品并未呈現出明顯的聚類趨勢，而由圖1B可知，QJ2和QJ3形成一個聚類，YSC1和YSC2形成一個聚類，因而基于非加權分析的同一類樣品間聚類趨勢要明顯于加權分析。較之UPGMA，基于UniFrac距離的UPGMA考慮了不同物種在進化譜系中的遺傳距離[19]，同時在此基礎上進行的加權分析還進一步考慮了OTU中序列豐度，而非加權分析僅考慮OTU中序列的有和無，有即為1，無則為0[20]。基于OTU相對含量矩陣，本研究進一步使用MANOVA對兩類鹽漬泡菜微生物群落結構的差異性進行了分析，結果顯示差異顯著（P<0.05）。由此可見，雖然在聚類圖中存在交疊現象，但兩類鹽漬泡菜的微生物群落結構差異顯著。

2.3 基于門、屬和OTU水平的相對含量比較

發酵沙蔥（A）和發酵青椒（B）中優勢菌門相對含量如圖2所示。

圖2 發酵沙蔥和發酵青椒中優勢細菌門相對含量Fig.2 Relative abundance of dominant bacterial phyla in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖2可知，發酵沙蔥中的優勢細菌門為Proteobacteria（變形菌門，49.92%）、Firmicutes（硬壁菌門，45.77%）、Actinobacteria（放線菌門，2.18%） 和 Bacteroidetes（擬桿菌門，1.44%）；發酵青椒中的優勢細菌門為 Proteobacteria（68.70%）、Actinobacteria（17.05%）、Firmicutes（10.08%）和 Bacteroidetes（2.30%）。經Mann-Whitney檢驗發現，發酵沙蔥中Firmicutes的相對含量顯著偏高（P<0.05）。

發酵沙蔥（A）和發酵青椒（B）中優勢細菌屬的相對含量如圖3所示。

圖3 發酵沙蔥和青椒中優勢細菌屬相對含量Fig.3 Relative abundance of dominant bacterial genera in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖3A可知，發酵沙蔥中有11個優勢細菌屬，分別為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus（乳酸桿菌屬，22.8%）、Lentibacillus（慢生芽胞桿菌屬，7.68%）、Weissella（魏斯氏菌屬，5.03%）、Gracilibacillus（糖球菌屬，3.70%）、Oceanobacillus（海洋桿菌屬，1.78%）和Bacillus（芽孢桿菌屬，1.51%），隸屬于 Proteobacteria的Pantoea（泛菌屬，13.54%）、Acinetobacter（不動菌屬，5.74%）、Pseudomonas（假單胞菌屬，5.70%）、Erwinia（歐文氏菌屬，3.21%）和 Rahnella（拉恩氏菌屬，3.11%）；由圖3B可知，發酵青椒中有8個優勢細菌屬，分別為隸屬于Proteobacteria的Pseudomonas（假單胞菌屬，31.35%）、Obesumbacterium（肥桿菌屬，7.70%）、Rouxiella（2.10%）和 Psychrobacter（嗜冷桿菌屬，1.61%），隸屬于Actinobacteria的Thermoleophilum（棲熱嗜油菌屬，16.31%）和 Kluyvera（克呂沃爾氏菌屬，8.93%），隸屬于Firmicutes的Lactococcus（乳球菌屬，3.08%）和Lactobacillus（乳桿菌屬，2.30%）。經 Mann-Whitney檢驗發現，發酵沙蔥中 Lactobacillus、Pantoea、Lentibacillus和Rahnella的相對含量顯著偏高（P<0.05）。沙蔥為百合科蔥屬植物，有研究表明Pantoea allii可導致與沙蔥同一屬的洋蔥發生枯萎病[21]，因而發酵沙蔥中存在Pantoea的原因可能在于制作過程中使用了患枯萎病的原料。由此可見，兩類鹽漬泡菜細菌類群在屬水平上存在較大的差異。

發酵沙蔥中存在68個特殊OTU，累計平均含量為8.40%，其中24個OTU隸屬于Pantoea，累計含量達5.54%；4個OTU隸屬于Pseudomonas，累計含量達0.025%；3個 OTU隸屬于 Rahnella，累計含量達0.045%；而其他OTU均不可鑒定到屬水平，且平均相對含量均低于0.01%。發酵青椒中存在2個特殊OTU，分別被鑒定為Lactobacillus和Bacteroides，平均相對含量分別為0.007%和0.03%。由此可見，兩類鹽漬泡菜在含量較低的OTU上存在一定的差異。

2.4 核心細菌類群的研究

在對不同樣品中獨特OTU進行甄別的基礎上，進一步對核心OTU進行了解析。共發現35個核心OTU，累計平均相對含量為17.23%，其中平均相對含量>1.0%的如圖4所示。

圖4 發酵沙蔥和青椒中優勢核心OTU相對含量Fig.4 Relative abundance of dominant core OTUs in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖4可知，共有6核心OTU平均相對含量>1.0%，累計平均相對含量達到12.34%，其中OTU4948、OTU789、OTU3975、OTU3978、OTU2257 和 OTU2191 的平均相對含量為3.38%、2.95%、2.16%、1.78%、1.07%和1.01%，除 OTU4948和 OTU789被鑒定為 Thermoleophilum外，其他4個OTU被依次鑒定為Weissella、Pseudomonas、Acinetobacter和 Lactobacillus。由此可見，雖兩類鹽漬泡菜在含量較低的細菌類群上存在差異，但亦共有部分相同的細菌類群。

2.5 基于PICRUSt功能預測分析

發酵沙蔥和發酵青椒細菌類群功能大類的注釋結果如圖5所示。

圖5 發酵沙蔥和青椒細菌基因功能預測Fig.5 Predict gene functions of bacteria in fermented Allium mongolicum Regel and Capsicum annuum var.grossum

由圖5可知，所有細菌共注釋到了4 166個GOG，分別隸屬于23個功能大類，且兩類鹽漬泡菜在氨基酸轉運與代謝（E）、碳水化合物運輸與代謝（G）以及轉錄（K）功能上均具有較高表達，而在RNA的加工與修飾（A）、染色質結構與動力學（B）和細胞運動（N）等功能上的表達較低。經Mood-median檢驗發現，發酵青椒中細菌在能量生產和轉換（C）、氨基酸轉運與代謝（E）、核苷轉運與代謝（F）和轉錄功能（K）的表達上顯著偏高（P<0.05）。由圖5可知，不同類型的樣品呈現出明顯的聚類趨勢，其中YSC1、YSC2和YSC3形成一個聚類，QJ1和QJ3形成一個聚類。基于基因功能預測數據矩陣，本研究進一步使用MANOVA對兩類鹽漬泡菜基因功能的整體差異性進行了分析，結果顯示差異顯著（P<0.05）。由此可見，兩類鹽漬泡菜細菌基因功能的表達存在顯著差異。

3 結論

兩類鹽漬泡菜在細菌類群和基因功能的表達上均存在顯著差異，其中發酵沙蔥細菌類群的豐度和多樣性及硬壁菌門、乳酸桿菌屬、慢生芽胞桿菌屬、泛菌屬和拉恩氏菌屬的相對含量均顯著偏高，而菌群能量生產和轉換、氨基酸轉運與代謝、核苷轉運與代謝和轉錄等功能基因的表達均顯著偏低。由此可見，原料對鹽漬泡菜的細菌類群與菌群基因功能的表達具有顯著的影響。