長鏈非編碼RNA DLX6-AS1通過靶基因miR-103a-3p調控宮頸癌SiHa細胞的分子機制

周倩 郝碩月 張海燕

(遼陽市中心醫院婦產科，遼寧 遼陽 111000)

宮頸癌是對女性健康威脅極大的一種惡性腫瘤，目前常采用的治療方式是手術、放化療等，一定程度改善了患者生存質量，但對于晚期和復發型患者的治療仍不理想，隨著分子生物學和基因組學的發展，靶向治療研究取得了重大進展，可提高療效、減少毒副作用[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可作為癌基因或抑癌基因影響腫瘤的發生發展，研究發現部分lncRNA可參與調控宮頸癌的增殖、遷移與凋亡，可作為宮頸癌診斷與預后的重要指標和潛在治療靶點[3]。DLX6反義RNA1(DLX6 antisense RNA1，DLX6-AS1)是一種lncRNA，定位于7q21.3，lncRNA DLX6-AS1的上調通過靶向miR-577促進食管鱗狀細胞癌的細胞生長和轉移[4]。敲低lncRNA DLX6-AS1抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲，同時促進細胞凋亡[5]。上調lncRNA DLX6-AS1促進大腸癌細胞增殖、侵襲和遷移[6]。研究發現微小RNA(miRNA)廣泛參與宮頸癌的發生、侵襲、轉移和復發等過程中[7]。有研究報道miR-103a在宮頸癌細胞系中低表達，上調miR-103a表達可減弱宮頸癌細胞增殖能力，并抑制細胞遷移及侵襲能力[8]。miR-103a-3p顯著抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[9]。但lncRNA DLX6-AS1對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其機制是否與miR-103a-3p有關還尚不清楚，本實驗探討DLX6-AS1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其是否通過調控miR-103a-3p的表達影響宮頸癌的進展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 正常宮頸細胞Ect1/E6E7和宮頸癌細胞株HeLa、SiHa、C33a、Caski購自北京北納創聯公司。RPMI-1640培養基購自美國Sigma公司；熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國Bio-Rad公司；抗體均購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自翊圣生物公司。載體質粒均購自上海伯易生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 正常宮頸細胞Ect1/E6E7和宮頸癌細胞株HeLa、SiHa、C33a、Caski用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養基于37 ℃、5% CO2細胞恒溫培養箱中培養，每天換液一次，待細胞融和至80%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代。

1.2.2 細胞處理與分組 Ect1/E6E7和宮頸癌細胞HeLa、C33a、Caski正常培養，培養48 h后收集細胞備用。取對數生長期細胞SiHa，將si-con、si-DLX6-AS1、pcDNA、pcDNA-DLX6-AS1、miR-con、miR-103a-3p分別轉染至SiHa細胞中，分別記為si-con組、si-DLX6-AS1組、pcDNA組、pcDNA-DLX6-AS1組、miR-con組、miR-103a-3p組；以正常培養的細胞作為對照(NC)組；將si-DLX6-AS1質粒分別與anti-miR-con、anti-miR-103a-3p共轉染至SiHa細胞中，分別記為si-DLX6-AS1+anti-miR-con組、si-DLX6-AS1+anti-miR-103a-3p組。具體轉染步驟按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.2.3 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測miR-103a-3p和DLX6-AS1表達水平 提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，具體操作方法參考文獻[5]，miR-103a-3p和DLX6-AS1分別以U6和GAPDH為內參，miR-103a-3p上游引物序列：5′-GCAGCAGC ATTGTACAGGG-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGG GTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列為：5′-GCCAGC ACCATGCTCTTCTA-3′，下游引物序列為：5′-GGT TCCACAGATGCTCAGGTC-3′；DLX6-AS1上游引物序列：5′-CCACCCACTGAGAGAAGAGG-3′，下游引物序列：5′-CCTCCAAGCAATTGTCCAGT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CAGGAGGCATTGCTG ATGAT-3′，下游引物序列：5′-GAAGGCTGGGGCT CATTT-3′。

1.2.4 蛋白質印跡(Western Blot)檢測CyclinD1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、MMP-2、MMP-9表達水平 細胞培養48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。具體操作方法參考文獻[5]，蛋白相對表達水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。

1.2.5 MTT檢測細胞活性 收集各組培養48 h的細胞，然后按照參考文獻[8]中的方法檢測，490 nm波長的吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組培養48 h的細胞，然后按照參考文獻[5]中的方法檢測細胞凋亡情況，每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.2.7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 侵襲實驗具體操作方法參考文獻[8]。遷移實驗除不用基質膠包被Transwell小室上室，其余與侵襲實驗操作相同。

1.2.8 熒光素酶報告實驗檢測DLX6-AS1對miR-103a-3p的靶向調控 構建DLX6-AS1的3′UTR野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-DLX6-AS1和MUT-DLX6-AS1，用LipofectamineTM2000將WT-DLX6-AS1和MUT-DLX6-AS1分別與miR-con和miR-103a-3p共轉染至SiHa細胞中。按照說明書進行檢測。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析，實驗重復3次。

2 結果

2.1 宮頸癌細胞株中DLX6-AS1和miR-103a-3p的表達 與正常宮頸細胞Ect1/E6E7相比，宮頸癌細胞HeLa、SiHa、Caski、C33a中DLX6-AS1表達水平升高，miR-103a-3p表達水平降低(均P<0.05)，見表1。

表1 宮頸癌細胞中DLX6-AS1和miR-103a-3p的表達Table 1 Expression of DLX6-AS1 and miR-103a-3p in cervical cancer cells

2.2 干擾DLX6-AS1表達對宮頸癌細胞SiHa增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與si-con組相比，si-DLX6-AS1組SiHa細胞中DLX6-AS1表達水平降低，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9表達水平降低，Bax、Cleaved caspase-3表達水平升高，細胞活性降低，細胞凋亡率升高，細胞遷移和侵襲數量降低(均P<0.05)，見圖1、表2、表3。

圖1 干擾DLX6-AS1表達對宮頸癌細胞SiHa凋亡、遷移和侵襲的影響Figure 1 The effect of interfering with the expression of DLX6-AS1 on the apoptosis,migration and invasion of cervical cancer cell SiHa注：A.流式細胞術檢測宮頸癌細胞SiHa凋亡率;B.Western blot檢測CyclinD1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、MMP-2和MMP-9的表達;C.Transwell檢測宮頸癌細胞SiHa中遷移和侵襲

表2 干擾DLX6-AS1表達對宮頸癌細胞SiHa增殖和凋亡的影響Table 2 Effect of interfering with DLX6-AS1 expression on proliferation and apoptosis of cervical carcinoma cell SiHa

表3 干擾DLX6-AS1表達對宮頸癌細胞SiHa遷移和侵襲的影響Table 3 Effect of interfering with DLX6-AS1 expression on migration and invasion in cervical carcinoma cell SiHa

2.3 DLX6-AS1靶向調控miR-103a-3p的表達 Targetscan預測顯示DLX6-AS1與miR-103a-3p存在結合位點(見圖2A)。相較于miR-con組(1.00±0.13)，miR-103a-3p組(0.65±0.08)轉染WT-DLX6-AS1的SiHa細胞的熒光素酶活性顯著降低(t=6.879，P<0.05)；而轉染MUT-DLX6-AS1的SiHa細胞miR-con組(1.23±0.12)與miR-103a-3p組(1.31±0.15)的熒光素酶活性差異無統計學意義(t=1.249，P=0.230)。RT-qPCR檢測結果顯示，相較于si-con組(1.00±0.08)，si-DLX6-AS1組(3.68±0.28)miR-103a-3p表達水平顯著升高(t=27.609，P<0.05)；相較于pcDNA組(1.06±0.13)，pcDNA-DLX6-AS1組(0.63±0.07)miR-103a-3p表達水平顯著降低(t=8.737，P<0.05)。

2.4 轉染miR-103a-3p對宮頸癌細胞SiHa的抑制作用 與miR-con組相比，miR-103a-3p組SiHa細胞中miR-103a-3p表達水平升高，MMP-2、MMP-9、CyclinD1、Bcl-2表達水平降低，Bax、Cleaved caspase-3表達水平升高，細胞活性降低，細胞凋亡率升高(P<0.05)，見圖2B、表4。

表4 轉染miR-103a-3p抑制宮頸癌細胞SiHa增殖、遷移、侵襲和誘導凋亡Table 4 Transfection of miR-103a-3p inhibits proliferation,migration,invasion and induces apoptosis in cervical cancer cells SiHa

2.5 沉默DLX6-AS1表達和干擾miR-103a-3p表達對宮頸癌SiHa細胞生物學特性的影響 與si-DLX6-AS1+anti-miR-con組相比，si-DLX6-AS1+anti-miR-103a-3p組SiHa細胞中miR-103a-3p表達水平降低，MMP-2、MMP-9、CyclinD1、Bcl-2表達水平升高，Bax、Cleaved caspase-3表達水平降低，細胞活性升高，細胞凋亡率降低(均P<0.05)，見圖2C、表5。

圖2 DLX6-AS1與miR-103a-3p靶向關系和轉染miR-103a-3p或共轉染si-DLX6-AS1與miR-103a-3p對細胞增殖遷移和凋亡蛋白表達的影響Figure 2 DLX6-AS1 and miR-103a-3p targeting relationship and the effects of transfection of miR-103a-3p or co-transfection of si-DLX6-AS1 and miR-103a-3p on cell proliferation,migration and expression of apoptosis proteins注：A.DLX6-AS1與miR-103a-3p存在的互補核苷酸序列;B、C.Western blot檢測MMP-2、MMP-9、CyclinD1和Cleaved caspase-3的表達

表5 沉默DLX6-AS1表達和干擾miR-103a-3p表達對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移、侵襲和誘導凋亡的影響Table 5 Effect of silencing DLX6-AS1 expression and interfering with miR-103a-3p expression on proliferation,migration,invasion and induction of apoptosis in cervical cancer SiHa cells

3 討論

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤，癌細胞的異常增殖、遷移和侵襲等影響癌癥的進展，尋找研究影響宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的相關lncRNA和miRNA，探討其可能調控的分子機制，通過調控其表達從而影響調控癌細胞增殖、遷移和侵襲，可為癌癥的治療提供新的思路，且lncRNA和miRNA或可作為腫瘤分子靶向治療的靶點和診斷及預后的生物標志物[10-13]。lncRNA DLX6-AS1通過靶向miR-613增強卵巢癌細胞的遷移和侵襲，在卵巢癌中發揮致癌基因的作用[14]。lncRNA DLX6-AS1在結直腸癌中也顯著高表達，通過海綿狀miR-577促進結直腸癌的增殖、遷移和侵襲[15]。lncRNA DLX6-AS1在胰腺癌組織中高表達，與較大的腫瘤大小，晚期TNM分期和淋巴結轉移呈正相關，敲除DLX6-AS1通過上調miR-181b抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲[16]。為研究lncRNA DLX6-AS1在宮頸癌中的作用，本實驗首先檢測了宮頸癌SiHa細胞中DLX6-AS1的表達，結果顯示DLX6-AS1在宮頸癌SiHa細胞中也顯著高表達，進一步干擾DLX6-AS1表達后發現，干擾DLX6-AS1表達降低了細胞活性，提高了細胞凋亡率，降低遷移、侵襲數量，降低了細胞周期素D1(CyclinD1)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)、基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達水平，提高了Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Cleaved caspase-3)表達水平。

為研究DLX6-AS1是否通過調控miRNA影響宮頸癌SiHa細胞的生物學行為，本實驗通過生物信息在線軟件對DLX6-AS1靶向的miRNA進行預測，結果顯示，DLX6-AS1與miR-103a-3p存在結合位點，又通過熒光素酶實驗證實了DLX6-AS1可靶向調控miR-103a-3p。有研究報道miR-103a-3p過表達能夠抑制肝癌細胞的增殖，引起細胞周期G0/G1期阻滯，促進其凋亡[17]。miR-103a-3p通過靶向抑制ATF7促進胃癌細胞的增殖[18]。而本實驗結果顯示，miR-103a-3p在宮頸癌SiHa細胞中低表達，miR-103a-3p過表達可降低SiHa細胞活性，提高細胞凋亡率，降低遷移、侵襲數量，降低CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達水平，提高Bax、Cleaved caspase-3表達水平。此外，研究還發現Linc00152通過調節miR-103a-3p/FEZF1/CDC25A途徑促進神經膠質瘤干細胞的惡性進展[19]。circTCF25可通過miR-103a-3p/miR-107調控CDK6的表達促進膀胱癌的增殖和遷移[20]。說明lncRNA可通過靶向調控miR-103a-3p影響腫瘤的進展，本實驗結果表明DLX6-AS1可靶向調控miR-103a-3p的表達，且抑制miR-103a-3p表達逆轉了干擾DLX6-AS1表達對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡促進作用。

4 結論

干擾 DLX6-AS1表達可抑制宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，其機制可能與miR-103a-3p表達有關，可能為宮頸癌的治療提供新思路和新靶點。