馬錢子治療骨關節炎的潛在藥物靶標*

張海燕 武志佳 王延之 曹紀輝 趙昱東 朱明雙，

(1.成都中醫藥大學，四川 成都 610075；2.成都第一骨科醫院康復科，四川 成都 610000；3.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610072)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是以關節疼痛、壓痛以及關節活動障礙等為主要臨床表現的退行性疾病,而關節疼痛及壓痛是OA最常見的臨床表現，故骨關節炎的治療常以緩解疼痛為目的[1-3]。馬錢子雖有大毒，但馬錢子及馬錢子復方制劑已廣泛用于各種疼痛治療[4-6]。有研究[6-9]發現，馬錢子可用于治療骨折腫痛、關節炎、風濕痹痛、腰腿痛等骨傷科疾病，且有顯著的鎮痛抗炎作用，這提示馬錢子治療OA的巨大潛力。網絡藥理學作為一門整合了分子生物學、計算機與大數據的新興學科，為研究中藥防治疾病的潛在靶標研究提供了新思路和方法。故本文將運用網絡藥理學分析馬錢子治療骨關節炎的潛在靶標，以期馬錢子更好地服務于臨床。

1 資料與方法

1.1 主要數據庫

1.1.1 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP) 該數據庫提供了中藥的化學成分較全面的人體吸收、分布、代謝(ADME)性質評價數據。而且還提供了潛在活性成分的靶標及其疾病信息。

1.1.2 GeneCards數據庫 該數據庫是一個人類基因在線的綜合性數據庫，它自動整合約125個網絡來源的基因的數據，提供了簡明的基因、蛋白組、轉錄、遺傳和功能上所有已知和預測的人類基因。

1.1.3 在線人類孟德爾遺傳數據庫(On line Mendelian Inheritance in Man,OMIM) 這是一個關于人類基因和遺傳疾病的綜合性數據庫，是具有全面性、及時性、權威性和實用性公認的高效信息平臺[10]。

1.2 主要軟件 Cytoscape3.7.2,Perl軟件(V5.30.1)，R語言軟件(V3.6.2)

1.3 方法

1.3.1 檢索及篩選馬錢子及其主要成分 檢索TCMSP數據庫得到馬錢子所有已知成分共62種，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)作為馬錢子化學成分的篩選條件，即OB≥30%，DL≥0.18為條件檢索TCMSP數據庫，篩選出符合條件的中藥活性成分，共檢索到13個化學成分。

1.3.2 篩選出馬錢子主要活性成分相關的作用靶基因 應用TCMSP數據庫，并運用R語言和Perl軟件篩選出符合1.3.1條件馬錢子活性成分的靶基因，共計115個。利用Uniprot數據庫，查詢靶基因與相對應的Symbol，未有相對應的則刪除，獲得91個靶基因。

1.3.3 構建OA疾病相關靶基因基因數據庫 以“ostoarthritis”為關鍵詞，檢索GeneCards、OMIM數據庫，得到與人類OA相關的靶基因。其中GeneCards數據庫檢索獲得2831個靶基因，OMIM數據庫獲得27個靶基因。

1.3.4 構建藥物-疾病交集圖(Venny圖) 刪除GeneCards、OMIM數據庫獲得的重復靶基因，得到OA疾病相關靶基因2858個，并刪除重復的藥物相關靶基因，獲得馬錢子相關靶基因44個，獲得二者交集的靶基因17個，構建藥物-疾病的venn圖，并應用Cytoscape3.7.2軟件對結果進行可視化處理。

1.3.5 構建中藥-疾病相互關系網絡 構建中藥-活性成分-靶基因-疾病相互關系網絡即network，運用Cytoscape3.7軟件，將network可視化。

1.3.6 PPI網絡構建及關鍵蛋白篩選 將2.5獲得的中藥-疾病靶點基因的交集運用String數據庫構建蛋白相互作用網絡(PPI)，分析靶點基因相互關系。相互作用評分設置為“medium confidence(0.40)”，并隱藏游離點，得到靶點基因之間相互關系的PPI網絡。然后對PPI網絡進行拓撲分析，獲取關鍵靶蛋白10個。

1.3.7 GO功能和KEGG通路富集分析 將1.3.4獲得的中藥-疾病的17個靶基因進行基因GO(gene ontology,GO)功能和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析，進一步挖掘馬錢子防治OA的潛在靶標。

2 結果

2.1 馬錢子主要有效成分 馬錢子主要活性成分篩選結果根據OB%和DL篩選出13個符合條件的有效成分，見表1。

表1 馬錢子主要有效成分Table 1 Main active components of nux vomica

2.2 構建藥物-疾病靶點基因交集venn和PPI結果

2.2.1 藥物-疾病相關靶點基因共17個(表2)，并將結果運用Cytoscape3.7軟件可視化(圖1)。這17個靶基因可能是馬錢子治療OA關鍵靶基因，查閱文獻發現主要與核受體家族轉錄因子密切相關，同時也涉抗炎和鎮痛相關的靶基因。

表2 馬錢子治療OA關鍵靶點Table 2 The key target of The treatment of OA by nux vomica

圖1 藥物-疾病靶點基因交集表Figure 1 Drug-disease target gene intersection table

2.2.2 運用String數據庫構建PPI網絡，篩選出10個符合1.3.6條件的關鍵蛋白，并構建了柱狀圖(縱坐標代表蛋白的名稱；橫坐標代表數目，數目越多代表蛋白居于關鍵中心)，PPI結果與2.2.1相一致，見圖2。

圖2 PPI關鍵蛋白柱狀圖Figure 2 PPI key protein bar chart

2.3 藥物-活性成分-基因-疾病相互關系可視化結果 黃色-疾病(OA)，藍色-中藥馬錢子，三角形綠色-活性成分，六邊形綠色-靶基因，見圖3。

圖3 藥物-活性成分-基因-疾病Figure 3 Drug-active ingredient-gene-disease

2.4 馬錢子治療OA的潛在靶點分析 GO功能分析結果顯示核受體可能是馬錢子治療OA的潛在藥物靶標(圖4)；KEGG富集分析顯示馬錢子治療OA的相關信號通路主要有5條，包括雌激素信號通路、脂肪細胞脂解信號通路等，見圖5。

圖4 馬錢子治療OA關鍵靶點GO功能注釋(僅顯示示前20條)Figure 4 Notes on the function of the key targets in the treatment of OA

圖5 馬錢子治療OA關鍵靶點參與的通路富集氣泡圖Figure 5 Bubble map of pathway enrichment involving key targets of nux vomica therapy for OA

3 討論

本研究基于網絡藥理學并挖掘相關數據庫和應用各種軟件探討馬錢子治療骨關節炎的作用機制和潛在藥物靶點，結果顯示馬錢子治療骨關節炎的關鍵靶點主要有雌激素受體α(ESR1)、孕酮受體(PGR)、核受體亞家族3C組成員(NR3C1)、雌激素受體β(ESR2)、雄激素受體(AR)等，而這些都是核受體超家族(Nuclear receptor，NR)重要成員。同時，GO功能富集分析也發現馬錢子治療OA的基因功能與核受體家族相關，而這其中類固醇激素受體與馬錢子治療OA的關系最為密切。隨著基因組學、蛋白質組學及代謝組學等學科的發展，使研究者對OA的潛在靶點有了新的認識。越來越多證據表明，核受體是治療OA潛在藥物靶標[11-13]。有研究[13]發現，人關節軟骨中可以檢測到NR的表達，并且OA患者與健康者軟骨中的NR表達存在差異。

核受體在配體介導的轉錄和基因表達調控中起著重要作用，他們與其相應配體(通常是指親脂小分子)結合誘導了它們作為轉錄激活因子的功能[14]。目前在人類中已經發現48個NR轉錄因子，根據其配體可以將其分為類固醇激素受體，非類固醇激素受體，以及其各自的配體尚未被發現的“孤兒”受體[15]。根據網絡藥理學結果顯示類固醇激素受體與馬錢子治療OA的關系最為密切。雌激素核受體ESR1和ESR2作為重要的類固醇激素受體，其廣泛分布于人體組織，且在關節軟骨、軟骨下骨以及軟骨細胞亦有表達[16-18]。研究[19]發現，雌激素可以通過與ESR1和ESR2結合來參與骨發育成熟和骨代謝功能。但二者的作用并非一樣，研究證實，ESR1主要參與成骨細胞的生長，而ESR2與骨的形成與重吸收密切相關。而且OA患者ESR1基因與骨贅分級密切相關[20-22]。同時有學者在OA患者的滑膜細胞中鑒定出了類固醇激素受體(GR、AR、ERα、ESR2)，研究發現當關節內糖皮質激素注射后，類固醇激素受體(GR、AR、ESR1、ESR2)陽性細胞數量均明顯減少[23]。此外，雌激素受體α陽性細胞的減少與疼痛和關節殘疾評分的VAS的改善顯著相關[24]。

馬錢子為馬錢科植物馬錢的成熟干燥種子，其鎮痛作用療效顯著，但馬錢子的毒副反應限制了其臨床應用，因此臨床運用時應嚴格遵照醫囑。安全用藥的關鍵是掌握適當的炮制方法及控制用量，2015版《中國藥典》規定馬錢子炮制后以丸散入藥效果為佳，成人每日安全用量為0.3～0.6 g。因為馬錢子的治療量和中毒量接近，臨床用藥時須考慮患者體質、年齡及基礎疾病等，同時從小劑量開始逐漸加量，以服藥后患者無口舌麻木、肌肉抽搐等癥狀為宜[7]。雖然隨著制藥技術的發展，馬錢子的新劑型越來越多，但2015版《中國藥典》記載馬錢子口服藥用劑型主要為散劑、片劑、丸劑及膠囊為主，外用主要以膏劑為主[25]。故我們研究了馬錢子治療OA時是基于其口服后在人體吸收、分布代謝。

本研究基于網絡藥理學發現馬錢子治療OA具有多成分、多途徑、多靶點的特點。馬錢子治療OA的關鍵靶點包括PTGS1、ESR1、PTGS2、PGR、NR3C1、HTR3A、OPRD1、ADRB2、SLC6A4、OPRM1、NOS2、AR、F7、ESR2、PLAU、CAT、HAS2，然后利用各種數據庫和軟件進行GO功能和KEGG富集分析，發現這些靶點基因涉及到核受體活性(nuclear receptor activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)，同時與雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、調節脂肪細胞中脂肪的信號(Regulation of lipolysis in adipocytes)等有關。此外，我們查閱相關文獻并結合網絡藥理學結果發現馬錢子治療OA的潛在靶點與核受體密切相關，而其中類固醇激素受體與OA最為密切，因此本文在這方面進行了重點闡述。綜上，核受體家族某些成員(ESR1、PGR、NR3C1、ESR2)可能是馬錢子治療骨關節炎潛在藥物靶標，這為馬錢子治療OA提供了新的研究方向。

4 結論

馬錢子治療OA具有多途徑、多成分、多靶點特點，核受體家族可能是馬錢子治療骨關節炎的潛在藥物靶標。