UHPLC/Q-Orbitrap-MS結合化學計量學方法研究酸棗仁入血成分

武錦春，杜晨暉，秦雪梅，閆 艷*

(1.山西大學 中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006；2.山西中醫藥大學 中藥學院，山西 晉中 030619)

中藥的精髓在于多組分、多環節協同發揮效應。多數情況下，中藥需要吸收入血，通過代謝轉化生成活性產物后才能發揮整體藥效作用。因此，選取有效成分時，應與藥效和代謝關聯分析才更精準、全面[1]。此外，當機體處于不同狀態下藥物的分布及消除明顯不同[2]，因此考察病理狀態下中藥成分在體內的吸收、代謝等過程更有意義。中藥的化學成分復雜，加之內源性成分的干擾使得檢測和鑒定藥源性代謝物十分困難。經典的體內代謝產物鑒別方法是通過比較空白樣品和給藥后樣品的色譜圖，從復雜的背景中提取低響應的藥源性代謝產物的信號，但該方法周期長、成本高。化學計量學具有大數據運算的優勢，能在不損失信息的情況下，通過變換和構造模型，使復雜數據簡單化[3-4]。將化學計量學的主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)應用于中藥體內代謝產物的鑒別分析中，將大大加快從化學測量數據中最大限度提取有用化學信息的速度，提高鑒別準確性。

酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，具有養心補肝、寧心安神、斂汗、生津之功效[5]，是中醫治療失眠之要藥。藥理學研究表明，酸棗仁水提物具有鎮靜催眠、抗焦慮性抑郁等作用[6-7]；其醇提物具有抗心律失常、抗心肌缺血等作用[8]。植物化學研究表明，酸棗仁本底化學成分基本清晰，主要含有皂苷類、黃酮類、生物堿類和脂肪酸類成分[9]。酸棗仁體內代謝研究雖有報道，但多集中于酸棗仁總黃酮部位或幾個主要單體化合物的研究[10-12]。本課題組前期采用超高效液相色譜-靜電場軌道離子阱質譜(UHPLC/Q-Orbitrap-MS)研究了正常大鼠灌胃酸棗仁水提物后的入血成分[13]，然而對于失眠模型大鼠口服給予酸棗仁水提物的入血成分研究尚屬空白。

高分辨質譜儀能獲得準確、豐富的數據信息，同時利用化學計量學大數據運算的優勢，可使復雜信息簡單化，能夠快速、準確識別目標成分。因此，本文采用UHPLC/Q-Orbitrap-MS結合化學計量學方法，研究對氯苯丙氨酸(PCPA)誘導的失眠模型大鼠口服給予酸棗仁水提物后的入血成分。通過對比模型組與給藥組大鼠血清樣品的色譜數據，并結合PCA和OPLS-DA等化學計量學方法發現并識別入血成分。該方法可快速、全面地檢測潛在藥物入血成分，為進一步闡明酸棗仁藥效物質基礎及進行質量控制提供參考依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機、四元梯度泵(HPG-3400RS)、柱溫箱(TCC-3000RS)、自動進樣器(WPS-3000TRS)，Thermo ScientificTMQ ExactiveTMFocus質譜儀(德國Thermo公司)；全自動氮吹濃縮儀(TV1603N21312，英國Biotage公司)。

乙腈(質譜級，西班牙Fisher公司)，甲酸、甲醇(色譜級，德國Merck公司)；實驗用水為Milli-Q超純水；其它試劑均為分析純。

烏藥堿(批號HC225036198)、木蘭花堿(批號20160710)、維采寧Ⅱ(批號 HV187847198)、6?-阿魏酰斯皮諾素(批號20160303)、斯皮諾素(批號20160314)、酸棗仁皂苷A(批號20160315)均購于寶雞市辰光生物科技有限公司；酸棗仁皂苷B(批號20170210)購于南京春秋生物工程有限公司。經高效液相色譜(HPLC)歸一化法測得對照品的質量分數均大于98%。

酸棗仁飲片購自山西振東道地藥材有限公司(批號：20161108)。經山西中醫藥大學中藥鑒定教研室杜晨暉副教授鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子，留樣于山西大學中醫藥現代研究中心冷庫。健康雄性SD大鼠(180～220 g)，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(SCXK京2016-0006)。

1.2 酸棗仁水提物的制備

酸棗仁(ZSS)水提物的制備參考課題組前期方法[14]，取酸棗仁樣品約100 g，粉碎(60%過1號藥典篩)，精密稱定，加10倍量水，浸泡30 min，加熱至沸，回流提取2 h，過濾。濾渣再加8倍量水，繼續回流提取2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至0.5 g/mL(生藥量計)，冷凍干燥，得酸棗仁水提物凍干粉。

1.3 動物造模與給藥

24只SD大鼠在室溫22～24 ℃，相對濕度55%～65%的環境中適應性飼養1周后，隨機分為2組：空白組(NC，n=6)，模型組(IM，n=18)。模型組18只大鼠連續3 d腹腔注射PCPA混懸液400 mg/kg(0.5%羧甲基纖維素鈉，0.5%CMC-Na)[15]。于第二天末注射后眼眶取血，NC組大鼠同法眼眶采血，離心(3 500 r/min，4 ℃，10 min)，得血清。采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法[16]測定血清中5-羥色胺(5-HT)的質量濃度。將18只造模成功大鼠隨機分為3組，分別為IM組、給藥(IM+ZSS)2 h組和4 h組。后兩組于PCPA腹腔注射第三天后1 h開始給藥(30 g/kg ZSS)，連續給藥5 d，每天2次，末次給藥前禁食12 h(自由飲水)。NC組和IM組給予等體積的0.5%CMC-Na溶液。

1.4 樣品采集及制備

IM組和NC組大鼠于末次給予0.5%CMC-Na溶液1 h后腹主動脈取血，IM+ZSS組大鼠分別于給藥后2 h和4 h腹主動脈取血，離心(3 500 r/min，4 ℃，15 min)，收集上清液，得血清樣品，-80 ℃冷凍保存備用。

分別取2 h和4 h含藥血清樣品各100 μL等體積混合，其他組血清樣品各取200 μL于1.5 mL EP管中，分別加入600 μL甲醇，渦旋混勻3 min，離心(13 000 r/min，4 ℃，10 min)，轉移上清液上樣于Oasis PRIME HLB 96孔μElution提取板(Waters公司)進行抽濾，收集濾液。氮氣吹干(37 ℃)，殘渣加100 μL初始流動相復溶，離心(13 000 r/min，4 ℃，10 min)，轉移上清液于內襯管中待分析。

質控(QC)樣本的制備為隨機抽取模型組和給藥組的血清樣品各2個，分別精密吸取50 μL制成混合樣本，按照以上處理制備QC樣本。

1.5 UHPLC/Q-Orbitrap-MS分析條件

1.5.1 色譜條件色譜柱為ACQUITY UPLC?HSS T3柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)。洗脫梯度：0～8 min，5%～17%B；8～10 min，17%B；10～11 min，17%～18%B；11～12 min，18%～20%B；12～17 min，20%～23%B；17～22 min，23%～33%B；22～30 min，33%～60%B；30～32 min，60%～100%B；32～34 min，100%B；34～36 min，100%～5%B；36～40 min，5%B。流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為3 μL。

1.5.2 質譜條件離子源：電噴霧電離(ESI)源；正、負離子切換掃描；工作模式：全掃描-數據依賴二級掃描(Full MS-ddMS2)；質譜參數為：鞘氣流速：30 arb(ESI+)、35 arb(ESI-)；輔助氣流速：10 arb；噴霧電壓：3.5 kV(ESI+)、3.0 kV(ESI-)；正離子模式下的歸一化裂解能量(NCE)為20%、30%、50%，負離子模式下NCE為30%、45%、60%。毛細管溫度：320 ℃；離子源溫度：350 ℃；一級質量分辨率：70 000；掃描范圍：m/z100～1 500；動態排除持續時間：8 s。

圖1 各組大鼠血清中5-HT的質量濃度(n=6)Fig.1 The concentration of 5-HT in rat serum from each group (n=6) NC:normal control,IM:insomnia model,IM+ZSS: dosed group;***:significant difference

1.6 多元統計分析

LC-MS采集的原始數據經Thermo自帶Compound Discoverer (CD) 3.0軟件中Workflow TemplatesMetabolomicsUntargeted Metabolomics with Statistics Detect Unknowns with ID using Online Databases and mzLogic模塊進行預處理。Workflow設置如下：Min Precursor Mass：100 Da，Max Precursor Mass：1 500 Da；S/NThreshold：1.5；Mass Tolerance：5 ppm；Min Peak Intensity：50 000；Max Element Counts：C90、H190、N10、Na2、O90、P3、S5；RT Tolerance：0.5 min；Ions：[M+H]+、[M+Na]+、[2M+H]+或[M-H]-、[2M-H]-、[M+FA-H]-、[2M+FA-H]-。經過軟件進行峰提取、峰對齊、峰校準后得到一個保留時間、質荷比和強度的三維數據矩陣。對數據集的空缺值采用“80%原則”進行刪減[17]。空缺值用該組最小值的1/5進行填充，并進行SUM歸一化，數據導入SIMCA-P 14.0軟件(Umetrics AB)進行標準化后，進行PCA和OPLS-DA等多變量分析，通過OPLS-DA的變量投影重要性分析(VIP)和S-plot圖比較模型組與模型給藥組的差異離子，結合VIP>1發現差異性的藥源性代謝物。

2 結果與討論

2.1 失眠大鼠模型的復制

與NC組大鼠相比，IM組大鼠表現為興奮性增強，呈現易激怒、好爭斗的狀態；毛色暗淡、無光澤，脫毛現象明顯；糞便呈灰黃色、質地軟，排尿增多。各組大鼠血清中5-HT的質量濃度如圖1所示，與NC組相比，IM組大鼠血清中5-HT的質量濃度顯著降低，表明模型復制成功；與IM組相比，給予ZSS水提物(30 g/kg)后，IM+ZSS組大鼠血清中5-HT的質量濃度顯著升高。結果表明，ZSS水提物(30 g/kg)可改善大鼠血清中5-HT的質量濃度，從而改善失眠。

2.2 直觀分析與多變量統計分析

采用UHPLC/Q-Orbitrap-MS分析得到IM組和IM+ZSS組血清樣本的基峰離子圖見圖2。利用CD軟件對原始數據進行預處理，從正離子數據集提取46 644個信號離子，負離子數據集提取41 901個信號離子。

PCA是一種無監督的模式識別方法，能夠真實地反映原始數據的分組情況。QC組、IM組及IM+ZSS組大鼠血清樣本的PCA聚類得分圖如圖3所示，在正、負離子模式下，QC組、IM組和IM+ZSS組明顯聚成3類。QC樣品聚類良好，說明實驗數據質量好。此外，IM組和IM+ZSS組沿t[2]軸分開，表明服用ZSS水提物是造成樣品分類的主要原因。

根據來源,代謝指紋譜的變量理論上可分為3類：吸收的成分，新產生成分，藥物干預改變的內源性代謝物。外源性成分及其代謝物僅出現在藥物處理的樣品中，所以當使用代謝組學技術時，藥物處理模型組和模型對照組的差異主要來自外源性成分及其代謝物[18]。因此，為進一步找出IM+ZSS組相對于IM組的差異性藥源成分，采用有監督的OPLS-DA對兩組樣本進行分析。

如圖4A和4B所示，在正、負離子模式下，IM組與IM+ZSS組均可沿t[1]軸分開，R2X(cum，predictive+orthogonal)值分別為0.450和0.461，表明模型分別累積概括了PC1、PC2兩種整體信息的45.0%和46.1%。R2Y(cum)值均為1，表明模型可解釋因變量100%的變異信息。Q2(cum)值分別為0.858和0.904，表明模型可預測準確程度分別為85.8%和90.4%。用排列驗證和交叉驗證方差分析(CV-ANOVA)對模型進行驗證。如圖4C和4D所示，在正、負離子模式下，模型經200次置換檢驗，Q2點的回歸線與Y軸交于負軸。此外，CV-ANOVA的p值分別為0.004 29和0.005 15(p<0.05)，表明所建模型有效。如圖4E和4F所示，在正、負離子模式下，S-plot圖中代謝物距原點越遠，對分組差異貢獻 (VIP) 越大。

2.3 代謝產物的鑒別

將OPLS-DA模型所對應的S-plot載荷圖和VIP>1作為酸棗仁水提物口服給予失眠模型大鼠后藥源性入血原型成分和代謝產物的篩選標準。結果從正離子數據矩陣中提取出586個差異離子，負離子數據矩陣中提取出496個差異離子。這些離子應是酸棗仁外源性代謝物組的成分(原型成分或代謝產物)，或是服用酸棗仁引起濃度改變的內源性成分。然而，酸棗仁原型成分及其代謝產物只能在服藥后的樣品中檢出，而在模型對照組的樣品未檢出，內源性成分則在兩組均能夠檢出，只是濃度有改變。通過對比模型對照組，在正離子模式下提取出61個潛在藥源性物質；在負離子模式下提取出50個潛在藥源性物質。最終，在正離子模式下共鑒定7個差異藥源性代謝物，在負離子模式下共鑒定13個差異藥源性代謝物，包括11個原型成分及9個代謝產物(見表1)。其中，將烏藥堿、維采寧Ⅱ、木蘭花堿、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A及酸棗仁皂苷B與對照品比較進行鑒別。

2.3.1 生物堿及其代謝產物烏藥堿為酸棗仁中含量較高的芐基異喹啉類生物堿[14]。如表1所示，正離子模式下，烏藥堿(2號化合物)產生m/z286.141 45的分子離子峰，丟失NH3中性分子生成m/z269.12；m/z269.12相繼丟失CH3OH和CO生成碎片離子m/z237.09和209.10，或相繼丟失C6H6O、CH4O生成碎片離子m/z175.07、143.05。1號化合物與烏藥堿具有相同的二級碎片，參考文獻[19]，推斷其為6-葡萄糖烏藥堿。正離子模式下，MA1和MA2分別產生m/z462.174 59和m/z462.175 51的分子離子峰，較烏藥堿的分子量增加了176 Da，且與烏藥堿有相同的特征碎片離子，推測兩個化合物均為烏藥堿的葡萄糖醛酸化產物。

木蘭花堿為酸棗仁中的阿樸菲類異喹啉生物堿。如表1所示，正離子模式下，木蘭花堿(4號化合物)產生m/z342.169 37的準分子離子峰，其脫掉(CH3)2NH中性分子生成m/z297.11的碎片離子。m/z297.11通過中性丟失CH3，生成碎片離子m/z282.06，或相繼中性丟失CH3OH及CO分子生成碎片離子m/z265.09和m/z237.09。MA3產生m/z314.138 64的分子離子峰，比木蘭花堿少了28 Da，且產生和木蘭花堿相同的上述碎片離子，結合文獻報道[20]，初步推斷MA3是木蘭花堿去二甲基的產物。

表1 UHPLC/Q-Orbitrap-MS鑒定酸棗仁水提物灌胃的失眠大鼠血清中的原型成分及代謝產物Table 1 Prototype components and metabolites identified in serum of insomnia rats intragastricing administration of water extract of Ziziphi Spinosae Semen by UHPLC/Q-Orbitrap-MS

2.3.2 皂苷及其代謝產物酸棗仁皂苷類成分在負離子模式下響應較高，碎片豐富。負離子模式下，酸棗仁皂苷A(10號化合物)和酸棗仁皂苷B(11號化合物)的裂解規律(見表1)與文獻報道一致[21]。失眠模型大鼠血清中未檢測到酸棗仁皂苷的代謝產物酸棗仁皂苷元。研究表明，酸棗仁水提物體外經正常人體腸道菌群轉化后的腸道菌液中未檢測到酸棗仁皂苷元[21]。推測酸棗仁皂苷元可能通過糞便排泄，有待進一步的研究。此外，樣品備樣方法中，上清液上樣于Oasis PRIME HLB 96孔μElution提取板時，75%的甲醇過濾液可能導致極性較弱代謝物的吸附，造成濾液不含或較少含有這些成分，而使酸棗仁皂苷元未被儀器檢測到。

2.3.3 黃酮及其代謝產物斯皮諾素(7號化合物)和6?-阿魏酰斯皮諾素(9號化合物)是以芫花素為母核的6位黃酮碳糖苷類。如表1所示，負離子模式下，斯皮諾素與6?-阿魏酰斯皮諾素均通過中性丟失C4H8O4、C3H6O3和C2H4O2產生相同的碎片離子。負離子模式下，MF2和MF5均產生m/z283.06的碎片，同時分子離子峰分別比碎片283.06大176 Da和80 Da，因此推測其為芫花素肝腸循環代謝產生的芫花素葡萄糖醛酸化和硫酸酯化的產物。斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素在腸道發生水解反應生成當藥黃素和斯皮諾素，進一步發生裂解反應生成芫花素。負離子模式下，MF6產生分子離子峰253.050 32，結合文獻報道[22]，推測其為芫花素去甲氧基的產物。

正離子模式下，維采寧Ⅱ(3號化合物)產生m/z595.165 22的分子離子峰，隨后裂解產生m/z559.14[M-2H2O]-和457.11[M-H2O-C4H8O4]-的碎片離子，m/z457.11依次丟失中性分子CH2O、H2O分別生成m/z427.10、409.09等一系列典型的黃酮C糖30、60、90、120中性丟失的產物碎片。

異牡荊素(8號化合物)是以芹菜素為母核的6位黃酮碳糖苷類。負離子模式下，其產生m/z431.098 18的分子離子峰，并產生C糖的相同碎片。參考文獻[23]，推斷5號峰為異牡荊素-2″-O-β-D-葡萄糖苷。負離子模式下，MF1和MF4分別產生m/z349.001 74和445.077 91的準分子離子峰，繼而分別裂解脫掉80 Da和176 Da，產生碎片離子m/z269.05，因此推斷MF1和MF4是芹菜素硫酸酯化和葡萄糖醛酸化的代謝產物。MF3的準分子離子峰為m/z364.999 85，較芹菜素增加了96 Da，且產生碎片離子m/z285.04[M-H-80 Da]-，推斷為芹菜素羥基化和硫酸酯化的代謝產物。

綜上，與課題組前期研究結果相比[13]，正常與失眠模型大鼠血清中均檢測到原型成分烏藥堿、維采寧Ⅱ、異牡荊素-2″-O-β-D-葡萄糖苷、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B。然而，與正常大鼠相比，烏藥堿、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的血藥濃度在失眠病理狀態下發生了明顯改變[15]。

由表1可知，與失眠模型大鼠相比，正常大鼠血清中檢測到更多的原型成分，如酸李堿、當藥黃素、青天葵黃酮J、酸棗仁皂苷H、酸棗仁皂苷G和美洲茶酸。與正常大鼠相比，失眠模型大鼠血清中鑒定到的豐富的代謝產物，多為水解、硫酸化或葡萄糖醛酸化代謝產物。其原因可能為：①睡眠障礙與功能性消化不良、腸易激綜合征等腸道疾病有關[24-25]。失眠癥患者腸道菌群的數量、組成和多樣性發生了變化[26-27]。因此推斷失眠引起的腸道消化吸收功能和腸道菌群的改變導致酸棗仁中原型成分的吸收差異，促進了黃酮、生物堿和皂苷的代謝；②大鼠腹腔注射的PCPA通過改變去甲腎上腺素能系統和5-HT能系統影響肝臟細胞色素P450表達[28]，進而引起藥物代謝的差異。由此可見，正常大鼠血清中原型成分的種類豐富且濃度發生了變化，而失眠模型大鼠血清中代謝產物的種類更為豐富。

3 結 論

本文基于UHPLC/Q-Orbitrap-MS結合化學計量學方法研究了酸棗仁水提物口服給予PCPA誘導失眠大鼠后的入血成分。通過對比模型組與模型給藥組血清樣品的色譜數據并結合PCA和OPLS-DA的化學計量學方法，共鑒定出20個入血成分，包括11個原型成分及9個代謝產物。該方法有別于傳統的直觀分析法，能夠快速、準確地分析體內的入血成分。此研究結果可為明確酸棗仁的質量標志物提供科學依據。