一種基于R語言的大孔吸附樹脂預測模型的構建

孫艷艷,劉寶乾,劉建飛,魏鑒騰*,邸多隆*

(1.甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學院蘭州化學物理研究所 中國科學院西北特色 植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

多糖是中藥中重要的一類有效成分，在免疫調節、抗氧化、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂等[1]方面展示出顯著而獨特的生理、藥理活性，已成為中藥研究的重要方向之一。多糖的分離純化是開展多糖研究與開發的重要基礎，目前用于大分子分離純化的色譜填料和層析介質主要是天然多糖類和高分子聚合物類。基于吸附和解吸附分離純化機制的大孔吸附樹脂(Macroporous adsorption resin,MAR)是一類重要的高分子聚合物分離材料，已在分離純化中藥中小分子有效成分方面取得重要進展，但在分離純化中藥多糖方面尚處于起步階段。近年來，MAR在多糖分離中的研究與應用逐漸引起國內外研究者的關注。

MAR是一種不含交換基團、具有孔結構的有機高聚物，具有不溶于酸、堿及各種有機溶劑，比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、節省費用等諸多優點[2-4]。孫偉等[5]采用MAR技術富集純化桑白皮中的多糖成分，桑白皮多糖的純度提高了4.6倍，為桑白皮多糖的工業化生產提供了技術參考。Yang等[6]采用MAR技術分離純化南瓜渣中的多糖成分，色素和蛋白質的吸附率分別為84.3%和75.9%，多糖的回收率為84.7%，為高效利用南瓜多糖資源提供了理論依據。Hu等[7]采用MAR技術和DEAE-52纖維素聯用技術從苔草中分離出單一的酸性多糖和中性多糖。Liang等[8]利用AB-8樹脂、Sephadex G75凝膠和Sephadex G200凝膠聯用技術從石斛中分離純化出2種單一多糖，并表征了多糖的結構特征。MAR技術由于其獨特的吸附性質和物理化學性質，已在分離純化中藥有效成分方面被廣泛應用，但由于在MAR與目標分子的構效關系及其分離規律的基礎研究方面比較薄弱，導致無法在理論指導下進行MAR精準選擇。面對種類繁多的MAR，在預測和篩選對多糖具有最佳分離效能的MAR時，工作量巨大，且往往出現漏篩、誤篩。

R語言由Robert Gentleman和Ross Ihaka在20世紀90年代開發而來，其作為一種開源軟件，帶有豐富的工具包[9]，因統計與計算功能全面而深受國內外研究者的青睞，已廣泛應用于經濟學、醫學、地球科學及農學等研究領域的數據挖掘分析[10-11]。本研究采用R語言構建MAR參數(如孔隙率、比表面積、孔容、孔徑)、葡聚糖與吸附量之間的多源信息模型，利用多源信息模型預測和篩選對不同分子量多糖具有最佳吸附性能的MAR，以期為中藥多糖的分離純化提供理論支撐。經文獻檢索，未見相同文獻報道。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260液相色譜儀(美國Agilent Technologies)，包括：G1312A恒流泵、2200蒸發光檢測器、G1328B手動進樣器和Agilent Chemstation software工作站；TSKgel G3000PWxl色譜柱(7.8 mm i.d.×30 cm，7 μm)；KQ-250DE型數控超聲清洗機(昆山超聲儀器有限公司)；BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱、THZ-320臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司)。

無水乙醇(分析純，利安隆博華醫藥化學有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；葡聚糖系列對照品(分子量分別為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000，上海麥克林生化科技有限公司)；枸杞多糖(由中科院蘭州化學物理研究所中科院西北特色植物資源化學重點實驗室制備、提供)；LX-1180、LX-20、LX-T81、LX-T19和D101型(西安藍曉科技新材料股份有限公司)，主要性能參數(由西安藍曉科技新材料股份有限公司提供)見表1。

表1 MAR的主要性能參數Table 1 Main performance parameters of MAR

1.2 對照品溶液的制備

分別稱取不同規格的葡聚糖對照品(分子量為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000)40 mg，加水溶解并定容至10 mL，搖勻，即得質量濃度為4 mg·mL-1的系列對照品儲備溶液，備用。

1.3 色譜條件

TSKgel G3000PWxl色譜柱(7.8 mm i.d.×30 cm，7 μm)；流動相：100%水；流速：1 mL·min-1；檢測器：蒸發光檢測器；檢測溫度：80 ℃；進樣量：20 μL。

1.4 方法學考察

1.4.1 線性關系分別稱取不同規格的葡聚糖對照品(分子量為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000)80 mg，加水溶解并定容至10 mL，即得質量濃度為8 mg·mL-1的對照品儲備液，各加水稀釋制備成0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg·mL-1的葡聚糖對照品溶液，按照“1.3”色譜條件進行測定。以不同分子量葡聚糖的質量濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，得到上述5種葡聚糖的回歸方程和線性范圍(見表2)。由表2可知，同一種分子量的葡聚糖在0.125～8 mg·mL-1范圍內，峰面積與葡聚糖的質量濃度呈線性關系。

表2 不同分子量葡聚糖的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equations and linear ranges of different molecular weight glucans

1.4.2 精密度實驗取“1.2”制備的對照品溶液，按照“1.3”色譜條件測定多糖，重復進樣6次，色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.95%～4.1%，表明儀器精密度良好。

表3 MAR靜態吸附實驗結果Table 3 Experimental results of MAR static adsorption

1.4.3 穩定性實驗取“1.2”制備的對照品溶液，按照“1.3”色譜條件分別于0、3、6、9、12、24 h進樣檢測，色譜峰面積的RSD為3.2%～4.8%，表明不同分子量的葡聚糖溶液在24 h內穩定。

1.4.4 重復性實驗精密稱取不同分子量的葡聚糖40 mg各6份，按照“1.2”方法制備樣品溶液6份，按照“1.3”色譜條件測定多糖，色譜峰面積的RSD為3.1%～4.8%，表明方法重復性良好。

1.5 吸附實驗

1.5.1 靜態吸附實驗稱取5種MAR(LX-1180、LX-20、LX-T81、LX-T19和D101) 各0.5 g，分別置于具塞錐形瓶中，加入4 mg·mL-1的多糖溶液40 mL，于30 ℃下恒溫振蕩吸附24 h后，測定濾液中的多糖，按公式(1)計算吸附量[12-14]。

(1)

式中，Q為吸附量(mg·g-1)，C0為吸附前多糖的質量濃度(mg·mL-1)，C1為吸附殘液中多糖的質量濃度(mg·mL-1)，V1為提取液體積(mL)，W為樹脂質量(g)。按照上式計算得到5種MAR對不同分子量葡聚糖的吸附量見表3。

1.5.2 吸附預測模型建立采用“1.5.1”靜態吸附實驗數據，以葡聚糖的分子量/孔隙率、分子量/比表面積、分子量/孔容、分子量/孔徑為自變量參數，吸附量為因變量參數，利用Rstudio軟件建立回歸預測模型，并進行擬合性檢驗。

2 結果與討論

2.1 葡聚糖含量的測定

葡聚糖含量的測定方法多采用比色法[15-16]。本研究建立了高效液相色譜(HPLC)測定葡聚糖含量的方法，經“1.4”方法學考察，表明該方法準確、可靠。不同分子量葡聚糖的HPLC色譜圖見圖1，可知分子量為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000葡聚糖在色譜中的保留時間分別為9.68、8.78、8.49、7.52、6.73 min，說明葡聚糖分子量越小，越容易進入色譜填料的孔道，洗脫時所經過的路徑越長，保留時間較長。不同分子量葡聚糖保留時間的規律符合凝膠色譜分離機理。

2.2 MAR主要性能參數與吸附量的相關性分析

影響多糖吸附效果的因素主要包括多糖分子量和MAR的孔隙率、比表面積、孔容、孔徑，分別考察了分子量/孔隙率、分子量/比表面積、分子量/孔容、分子量/孔徑對多糖吸附量的影響。如圖2所示，隨著上述4種比值的不斷增加，不同MAR對葡聚糖的吸附量均表現為先增加后降低。推測是由于隨著分子量的增加，葡聚糖無法進入MAR內部，導致吸附量下降。

2.3 多源信息融合預測模型的建立

2.3.1 數據處理分子量/孔隙率、分子量/比表面積、分子量/孔容、分子量/孔徑和吸附量結果見表4。對采集的數據取自然對數，其特點歸納如下：數據集包含25組數據，每組數據包括4個自變量和1個因變量，其中因變量“吸附量”受其他4個自變量的影響。

2.3.2 模型架構中藥多糖具有修復肝損傷、降血糖、抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和免疫調節等多種生物活性，不同分子量范圍的多糖，生物活性有所差異[17]。本研究以25組數據中的變量為基礎，通過考察因變量受不同自變量之間的交互作用，構建MAR吸附多糖的多源信息融合模型。利用該模型預測MAR對中藥多糖的吸附作用，可避免多糖分離過程中樹脂選擇的盲目性。

表4 MAR數據分析Table 4 Data analysis of macroporous adsorption resin

2.3.3 訓練集與測試集劃分利用Rstudio軟件，采取隨機不放回抽樣模式，從25組數據中依次抽取17、18、19、20、21、22、23、24組數據作為訓練集建立模型，其余數據作為測試集進行驗證。隨機重復25次，計算不同模型的r2和均方根誤差(RMSE)(圖3)。綜合考慮r2和RMSE值，選取23組數據作為訓練集所建立的模型擬合度和預測能力較好。

2.3.4 利用訓練集建立模型利用Rstudio軟件，采取隨機不放回抽樣模式，從25組數據中抽取23組數據作為訓練集建立模型，依次重復20次，計算每次模型的擬合方程參數(見表5)。綜合考慮P值和r2，選擇表5中序號6的擬合方程作為預測模型方程(式2)，其r2為0.901 2,P值為0.000 782，RMSE為19.89。

Y=5.94X1-25.15X2+6.93X3+17.91X4+5.03X1X2-23.13X1X3+25.68X2X3+8.81X1X4-15.55X2X4+11.1X3X4-18.89X1X2X3+1.97X1X2X4-10.93X1X3X4+14.23X2X3X4-6.96X1X2X3X4-8.04(r2=0.901 2)

(2)

式中，Y為MAR對多糖的吸附量(mg·g-1);X1、X2、X3、X4分別為多糖分子量與MAR孔隙率、比表面積、孔容和孔徑的比值，并取自然對數。

表5 模型方程的參數Table 5 Parameters of model equation

2.3.5 利用測試集驗證模型利用Rstudio軟件以2組測試集數據對上述預測模型進行驗證，模型預測吸附量分別為36、97.3 mg·g-1，RMSE值為19.89，測試集的吸附量數據分別為7.85、96.85 mg·g-1，表明模型預測效果準確。

2.3.6 模型驗證實驗枸杞多糖是枸杞中發揮功效的主要物質基礎之一[18]。枸杞多糖LBP-009是本實驗室篩選出具有修復和預防藥物性肝損傷的枸杞多糖部位，根據枸杞多糖LBP-009的分子量，利用多源信息模型預測MAR對枸杞多糖的吸附效果。結果表明，LX-T19、LX-T81、LX-20、LX-1180和D101型樹脂對枸杞多糖的吸附量分別為114.13、112.03、117.40、98.27、72.18 mg·g-1，其中吸附效果最好的MAR為LX-20。利用MAR靜態吸附實驗進行驗證，發現LX-20型MAR對枸杞多糖LBP-009的吸附量為111.23 mg·g-1，其結果與預測值基本吻合。由此可見，利用Rstudio軟件建立的多源信息融合模型是準確可靠的。

3 結 論

本研究以葡聚糖分子量與MAR的孔隙率、比表面積、孔容、孔徑比值為變量函數，利用Rstudio軟件構建MAR對中藥多糖吸附量的多源信息預測模型，實現了從種類繁多的MAR中快速預測和篩選對多糖具有最佳分離效能的MAR。模型驗證實驗表明，所建立的預測模型準確性較高，可快速預測和篩選對中藥多糖具有最佳吸附效果的MAR類型，顯著地提高了工作效率，為MAR分離純化中藥多糖的研究提供了新思路。但該預測模型也存在一定的局限性：首先，本研究使用的目標分子和MAR樣本量較少，可能造成預測模型的偏差。其次，本研究采集數據時，只考慮MAR對中藥多糖的靜態吸附實驗，未結合靜態解吸附實驗和動態吸附/解吸附實驗結果，可能導致預測模型的局限性。同時，MAR分離多糖的影響因素十分復雜，本文考察的影響因素還不夠全面。