銀萊湯中主要成分的UPLC多波長寬動態測定及質量評價研究

郁映婷，劉 潔，白 辰，趙淑軍，楊 潔，吳 浩， 潘綺雪，劉鐵鋼*，肖紅斌*

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學 中醫藥研究院，北京 100029；3.北京中醫藥 大學 中藥分析與轉化研究中心，北京 100029；4.北京中醫藥大學 中醫學院，北京 100029； 5.新疆石河子大學 藥學院，新疆 石河子 832002)

銀萊湯是在經典名方銀翹散與保和丸的基礎上，結合北京中醫藥大學谷曉紅教授的臨床用藥經驗，形成的以肺胃同治為主要治則的臨床經驗方[1]。其由金銀花、萊菔子、連翹、黃芩、魚腥草、瓜蔞、前胡組成，功效為清肺瀉胃、宣肺止咳、辛涼清解、調和表里，臨床用于治療肺胃積熱型感冒患兒。銀萊湯能夠明顯改善患兒機體狀態，減少發病次數，總有效率可達95%[2]。藥理研究表明，銀萊湯有顯著的解熱抗炎作用[3]，能有效治療食積復合流感病毒感染小鼠肺部的炎癥損傷[4]，能通過促進免疫球蛋白的分泌、調控細胞因子之間的網絡平衡來增強機體黏膜免疫功能[5-7]，進而發揮其抗流感病毒的功效。銀萊湯目前處于中藥新藥研發階段，其藥理功效基本明確，然而尚未建立質量控制方法。

中藥復方成分具有復雜性，是君臣佐使多味藥材中多種化學成分的集合。中藥復方發揮藥效是由其中的一類或幾類成分協同起效，活性成分含量變化直接影響其質量和藥效[8-11]，因此建立綜合、全面的質量控制方法十分必要。目前，常以單一指標性成分控制中藥復方制劑的質量，不足以評價中藥復方的整體質量[12]。近年來，有較多學者采用多成分含量測定來控制中藥復方的質量，然而大部分研究僅測定中藥復方中的君藥和臣藥中活性成分或某一類成分的含量，忽視了佐使藥材，造成復方中部分藥材活性成分的遺漏，特征性較差[13-14]。基于此，本研究選擇銀萊湯的君(金銀花、萊菔子)、臣(連翹、瓜蔞)、佐(魚腥草)、使(黃芩、前胡)藥材中藥典指標性成分和響應值較強的成分，以及復方中發揮清熱解毒、抗菌抗炎功效的成分進行測定，以期綜合、全面地控制銀萊湯的質量。

相較單成分測定，多成分測定由于復方中各成分的紫外吸收及含量差異大，在同一波長下難以實現同時測定，若選用多個波長進行檢測，則需調用不同色譜圖進行數據處理，圖譜結果分析較繁瑣[15]。因此，本研究采用超高效液相色譜(UPLC)波長在線切換法建立同時測定銀萊湯中10種有效成分含量的方法，并測定3個批次中各成分含量用于質量穩定性、一致性評價，從而為該中藥復方的質量評價提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

安捷倫1290超高效液相色譜儀，配G4212A型DAD紫外檢測器、G1316C型柱溫室、G4226A型自動進樣器、G4220A型二元泵(美國Agilent公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AT201型1/10萬電子天平(瑞士梅特勒公司)；N-1300旋轉蒸發儀(日本EYELA公司)；BZF-50真空干燥箱(上海博訊醫療生物儀器股份有限公司)；MC268C恒溫恒濕電子防潮箱(萊茵邁瑞歐工業科技有限公司)；超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲酸、甲醇(色譜純，美國Sigma公司)；超純水為實驗室自制。

對照品(純度大于98%)：新綠原酸(X-014-180410)、綠原酸(L-007-171216)、隱綠原酸(Y-067-181216)、芥子堿硫氰酸鹽(J-043-180413)、連翹酯苷A(L-012-181216)、槲皮苷(H-011-180506)、黃芩苷(H-016-180322)、漢黃芩苷(H-019-180823)、千層紙素A苷(Q-046-181013)均購自成都瑞芬思生物科技有限公司;連翹酯苷I(FY3876B0516)購自南通飛宇生物科技有限公司。

金銀花(產地：山東，批號：1901024)、炒萊菔子(產地：河北，批號：1812077)、連翹(產地：山西，批號：1903063)、黃芩(產地：河北，批號：1901040)、干魚腥草(產地：湖北，批號：1811006)、瓜蔞(產地：江蘇，批號：1812065)、前胡(產地：浙江，批號：1811059)均購自北京太洋樹康藥業有限責任公司，由北京中醫藥大學王學勇教授鑒定，存儲于北京中醫藥大學中藥分析與轉化中心實驗室。

1.3 實驗方法

1.3.1 銀萊湯干膏粉的制備按照處方稱取金銀花30 g、炒萊菔子10 g、連翹15 g、魚腥草20 g、黃芩10 g、前胡10 g、瓜蔞15 g，置于5 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水，加熱回流提取1.5 h，重復提取3次，放冷過濾。合并3次濾液，減壓濃縮干燥至小體積，再經減壓干燥箱干燥后，制成粉末，保存于恒溫恒濕電子防潮箱。

1.3.2 混合對照品溶液的制備分別稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A、槲皮苷、黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩苷適量，精密稱定，加甲醇配成質量濃度分別為50.0、50.0、50.0、25.0、20.0、16.7、5.00、500、125、100 μg·mL-1的混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備取“1.3.1”銀萊湯干膏粉0.2 g，精密稱定，加適量50%甲醇溶解，轉移至50 mL容量瓶中，再加50%甲醇稀釋至刻度，使用前過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液即得。

1.3.4 色譜條件色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫：0～5 min，10%～15% B；5～10 min，15% B；10～16 min，15%～25% B；16～30 min，25%～32% B。柱溫為30 ℃，進樣體積為2 μL，流速為0.4 mL·min-1。采用波長切換：0～10 min，在320 nm波長下測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I；10～16 min，在350 nm波長下測定連翹酯苷A、槲皮苷；16～30 min，在320 nm波長下測定黃芩苷、千層紙素A苷和漢黃芩苷。

2 結果與討論

2.1 檢測成分的選擇

在檢測成分的選擇上，應綜合考慮銀萊湯復方君臣佐使藥材中的指標性成分和響應值較強的成分，以及復方中發揮清熱解毒、抗菌抗炎功效的成分。復方君藥金銀花中的酚酸類成分是清熱解毒的主要藥效物質，且新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸在金銀花中含量較高，其中綠原酸為指標性成分[16-17]；君藥萊菔子的主要活性成分為芥子堿，以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在，常作為萊菔子的質控指標成分[18]；臣藥連翹含有木脂素類、苯乙醇苷類、揮發油等多種成分，其中連翹酯苷類是主要的特征活性成分，具有顯著的抗菌、抗炎作用[19-21]，且連翹酯苷A為指標性成分；佐藥魚腥草中的槲皮苷等黃酮類化合物具有較強的肺部炎癥治療活性[22-23]，其中槲皮苷被用于質量控制[24]；使藥黃芩的活性成分為黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷等黃酮類化合物，是發揮抗炎、抗病毒的主要藥效物質[25-26]，其中黃芩苷為指標性成分。目前，2015版《中國藥典》暫未確定瓜蔞的指標性成分[12]；前胡的主要成分為脂溶性的香豆素類化合物[27]，但在水煎液中溶出較少，且前胡在銀萊湯復方中用量較小，因此未選擇瓜蔞和前胡中成分進行測定。綜上，本研究選擇新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A、槲皮苷、黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩苷為檢測成分。

2.2 樣品復溶溶劑的選擇

分別考察了水、50%甲醇、甲醇作為復溶溶劑的效果。結果表明，加水復溶后，溶液中雜質較多導致過濾困難，放置一段時間后樣品瓶底部有沉淀析出，影響測定；以甲醇復溶時，進樣檢測后發現色譜峰峰形不對稱，出現峰分叉現象，可能由于樣品溶劑強度大于流動相而出現了溶劑效應；50%甲醇對樣品有較好的溶解，并可減少雜質干擾。因此，最終選擇以50%甲醇作為樣品的復溶溶劑。

2.3 檢測波長的選擇

通過對10個成分的混合對照品溶液進行紫外吸收全波長掃描，發現新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A在326 nm波長下有最大吸收，槲皮苷在255、350 nm波長下有最大吸收，黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩苷在275 nm波長下有最大吸收。但黃芩苷類成分在275 nm波長下吸收強，吸光度過高，在同一色譜圖中與其他待測成分的色譜峰峰高比例不協調，因此選擇有較強吸收的320 nm波長作為待測成分的主要檢測波長。根據化合物的保留時間，最終確定的檢測波長切換程序如“1.3.4”所示。

由于復方中各成分的紫外吸收及含量差異大，若僅以某一單波長作為多成分的檢測波長，易遺漏復方中關鍵成分的信號。本實驗發現芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I在275 nm波長下信號較弱，無法準確定量；而在本實驗選定的3個波長中，槲皮苷僅在350 nm波長下有吸收。此外，對各成分的峰面積進行分析發現，綠原酸類和黃芩苷類成分在其最大吸收波長處的吸光度較高，與其他成分的峰高比例不協調，這對多成分同時定量的線性范圍確定帶來一定困難。基于此，本實驗針對吸收強的成分選擇有相對較強吸收的波長，對信號響應弱的成分選擇最大吸收波長進行在線切換動態檢測。綜上，相較單波長檢測，本實驗采用的波長在線切換動態檢測不僅能夠對不同成分進行同時測定，而且可兼顧所有成分吸光度值在合理的線性范圍內，可為中藥復方多成分同時測定提供參考。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適應性精密吸取混合對照品、供試品溶液2 μL，按照“1.3.4”色譜條件進行分析，結果見圖1。供試品與對照品中10種成分均在相同保留時間處出峰，且達到基線分離。

2.4.2 線性關系分別精密吸取適量“1.3.2”的混合對照品溶液，加甲醇稀釋，得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的質量濃度為0.781、1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μg·mL-1；芥子堿硫氰酸鹽的質量濃度為0.391、0.781、1.56、3.13、6.25、12.5、25.0 μg·mL-1；連翹酯苷I的質量濃度為0.313、0.625、1.25、2.50、5.00、10.0、20.0 μg·mL-1；連翹酯苷A的質量濃度為0.261、0.521、1.04、2.08、4.17、8.34、16.7 μg·mL-1；槲皮苷的質量濃度為0.078 1、0.156、0.313、0.625、1.25、2.50、5.00 μg·mL-1；黃芩苷的質量濃度為7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500 μg·mL-1；千層紙素A苷的質量濃度為1.96、3.91、7.81、15.6、31.3、62.5、125 μg·mL-1；漢黃芩苷的質量濃度為1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0、100 μg·mL-1的系列對照品混合溶液。取上述溶液各2 μL，按“1.3.4”色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品的質量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數(r)。結果表明，各成分在相應質量濃度范圍內線性關系良好，r不小于0.999 2(見表1)。

表1 各成分的線性關系、檢出限與定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of various components

2.4.3 檢出限與定量下限取“1.3.2”配制的混合對照品溶液，逐級稀釋，按“1.3.4”色譜條件進樣測定，分別以信噪比(S/N)為3和10時對應的質量濃度作為檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，測得10種有效成分的LOD為0.018 8～0.075 0 μg·mL-1，LOQ為0.062 5～0.250 μg·mL-1(見表1)。

2.4.4 精密度取同一對照品溶液，按“1.3.4”色譜條件連續進樣6次，分別計算峰面積。結果顯示，10種有效成分峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.040%～0.65%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩定性取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h精密吸取2 μL，按“1.3.4”色譜條件進樣測定。結果表明，10種有效成分峰面積的RSD為0.35%～1.6%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.6 重復性按照“1.3.3”方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取2 μL，按“1.3.4”色譜條件進行測定。結果表明，10種有效成分含量的RSD為0.52%～1.5%，表明該方法重復性良好。

2.4.7 加標回收率取6份已知各成分含量的銀萊湯干膏粉樣品0.1 g，精密稱定，加入10種有效成分對照品適量，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，在“1.3.4”色譜條件下進行測定，計算各成分的平均回收率和RSD(見表2)。結果表明，10種成分的平均回收率為95.1%～104%，RSD為0.80%～3.7%，方法準確度良好。

2.5 樣品含量測定

取3批銀萊湯干膏粉樣品，按照“1.3.3”制備供試品溶液，以“1.3.4”色譜條件進樣分析，得到10種成分的含量。由3批樣品中各化合物的平均含量明確化合物在銀萊湯中的含量分布(見圖2A)，同時計算3批樣品中化合物總含量的RSD及各化合物含量的RSD，明確化合物在不同批次中的穩定性(見圖2B)。

結果表明，10種有效成分的總含量達70.013 mg·g-1，3個批次銀萊湯中10種有效成分總含量的RSD為0.75%，各化合物含量的RSD均小于9.0%，表明不同批次銀萊湯的質量較為穩定；君藥金銀花和萊菔子，臣藥連翹，佐藥魚腥草及使藥黃芩中所測成分的含量分別占10種成分總量的22%、5%、73%，表明復方中除君藥外，其他各藥材活性成分也起著重要作用，因此評價銀萊湯質量時應綜合考慮。

本實驗測得10種成分的平均含量為0.204～38.129 mg·g-1，可見銀萊湯中有效成分的含量范圍跨度較大。其中以黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷的含量最高(均達6.172 mg·g-1以上)，其次為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸(均達3.875 mg·g-1以上)，芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A的含量較低(達1.493 mg·g-1以上)，以上成分較全面地涵蓋了復方中君臣佐使藥材的特征性成分，且批間含量差異相對較小(RSD依次為0.86%、0.98%、0.53%、1.3%、0.61%、1.2%、0.37%、0.75%、2.9%)，表明以上成分在不同批次銀萊湯中能夠穩定存在。槲皮苷的含量最低(為0.204 mg·g-1)，且在不同批次銀萊湯中含量的穩定性稍差(RSD為8.1%)，因此槲皮苷不宜作為銀萊湯的質量評價指標。

此外，黃芩苷、綠原酸可通過影響炎癥信號通路而發揮解熱鎮痛、抗炎作用，且具有廣譜抗菌、抗病毒作用[28-29]；漢黃芩苷可通過MLCK/pMLC2通路改善腸上皮屏障功能以減輕結腸炎[30];新綠原酸可作為AMPK/Nrf2信號激活劑，防止與急性和慢性炎癥性疾病相關的巨噬細胞介導的過度反應[31];隱綠原酸可通過調節NF-κB/MAPK信號級聯和Nrf2核易位來減輕炎癥損傷和抗氧化應激[32];芥子堿硫氰酸鹽是萊菔子中抗菌、促進胃腸運動的主要藥效物質[33]；連翹中的連翹酯苷類活性成分與其發揮清熱解毒作用密切相關[34]。綜上所述，黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A 9個成分不僅是與復方清熱解毒、抗菌抗炎密切相關的功效成分，且覆蓋了復方中多個關鍵藥材，同時在復方中能夠穩定存在，可作為銀萊湯的質量評價指標。

3 結 論

本研究建立了銀萊湯中主要成分的多波長寬動態UPLC測定方法，該方法簡便可靠、分析效率高，測定指標相對全面、合理可行，能更好表征及控制銀萊湯的質量。并篩選得到黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A 9個成分可作為銀萊湯復方的質量評價指標，從而綜合全面地評價銀萊湯的質量。